rhFGF-21對心肌缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　 1.觀察成纖維細(xì)胞生長因子-21(rhFGF-21)對H9c2心肌細(xì)胞I/RI的保護(hù)作用。
　　 2.驗(yàn)證rhFGF-21通過抗細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)H9c2細(xì)胞作用。
　　 3.驗(yàn)證rhFGF-21通過抗氧化應(yīng)激、抗炎發(fā)揮保護(hù)H9c2細(xì)胞作用。
　　 4.驗(yàn)證rhFGF-21通過Akt/GSK-3β發(fā)揮保護(hù)H9c2細(xì)胞作用。
　　 5.運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)探索rhFGF-21保護(hù)I/RI更多可

2、能的藥理作用機(jī)制。
　　 6.驗(yàn)證rhFGF-21通過改善細(xì)胞能量代謝發(fā)揮H9c2細(xì)胞保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1.在模型Ⅰ、Ⅱ的基礎(chǔ)上給予梯度濃度的rhFGF-21處理，之后CCK-8法測定各組相對存活率。
　　 2.在模型Ⅱ的基礎(chǔ)上給予梯度濃度的rhFGF-21處理，之后用Hoechst33258熒光染料對細(xì)胞核染色，觀察細(xì)胞核改變;用Stains-All染料對細(xì)胞進(jìn)行著色，觀察細(xì)胞形態(tài)變化;用

3、Western-Blot方法檢測各組中Caspase-3蛋白表達(dá)量的改變。
　　 3.在模型Ⅱ的基礎(chǔ)上給予梯度濃度的rhFGF-21處理，之后采用DHE熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子，Western Blot檢測炎癥因子TNF-α、PAI-1表達(dá)量。用qPCR檢測模型Ⅰ組、Ⅱ組中H9c2細(xì)胞內(nèi)rhFGF-21表達(dá)情況。CCK-8法檢測rhFGF-21對H2O2處理H9c2細(xì)胞的保護(hù)情況。
　　 4.在模型Ⅱ的基礎(chǔ)上給予梯度

4、濃度的rhFGF-21處理，之后收取細(xì)胞裂解液，用Western Blot檢測pAkt、pGSK-3β的表達(dá)情況;用選擇性Akt抑制劑API-2干擾Akt磷酸化，觀察其對rhFGF-21保護(hù)作用的影響。
　　 5.在模型Ⅱ的基礎(chǔ)上給予梯度濃度的rhFGF-21處理，之后收取細(xì)胞裂解液，經(jīng)前處理后使用2D-GE技術(shù)分離蛋白質(zhì)，應(yīng)用2D-Master軟件分析差異斑點(diǎn)，對差異顯著的蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，歸類分析。
　　 6.對

5、于蛋白質(zhì)組學(xué)分析出ATP合酶在rhFGF-21作用下發(fā)生了改變，考慮到rhFGF-21可能是對于細(xì)胞能量代謝進(jìn)行了干預(yù)，因此我們進(jìn)一步對各組能荷變化行實(shí)驗(yàn)論證。
　　 結(jié)果：
　　 1.在細(xì)胞活性檢測實(shí)驗(yàn)中，CCK-8檢測顯示，在模型Ⅰ組與模型Ⅱ組中，rhFGF-21處理組對比模型組細(xì)胞存活率均有顯著增加(P＜0.05)，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。小劑量多次給藥實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，量效關(guān)系的表象是由于rhFGF-21半衰期短（降解）造成的，

6、而rhFGF-21保護(hù)作用實(shí)質(zhì)上是時(shí)間依賴性效應(yīng)，即一段時(shí)間內(nèi)保持rhFGF-21低濃度穩(wěn)定即可發(fā)揮保護(hù)作用。同時(shí)rhFGF-21各種劑量均不具有促H9c2細(xì)胞增殖作用(P＞0.05)，極高劑量(＞4μg/ml)可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。
　　 2.抗凋亡相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，rhFGF-21可明顯抑制IR誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)變化;亦可減少凋亡引發(fā)的細(xì)胞核碎裂(P＜0.05);凋亡信號特異性蛋白Caspase-3在模型組中斷裂激活的量顯著升高，而給予rh

7、FGF-21處理后激活減少(P＜0.05)。
　　 3.抗氧化應(yīng)激相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，rhFGF-21處理組中的超氧陰離子含量明顯少于模型組。在H2O2模擬氧化應(yīng)激損傷實(shí)驗(yàn)中，rhFGF-21也表現(xiàn)出顯著保護(hù)作用。此外，模型組中內(nèi)源性的rhFGF-21表達(dá)隨損傷的加劇而減少。
　　 4.pAkt以及下游GSK-3β的磷酸化水平在I/RI時(shí)顯著下降，rhFGF-21處理后其磷酸化水平得以恢復(fù)，而運(yùn)用Akt抑制劑則可拮抗rhFGF-

8、21的保護(hù)作用。
　　 5.在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，通過2D-Master軟件對比分析找出了64個(gè)差異斑點(diǎn)，并對其中26個(gè)蛋白斑點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定。之后依據(jù)蛋白質(zhì)在各組中的表達(dá)情況進(jìn)行分類，重點(diǎn)討論了I/RI和rhFGF-21相關(guān)性的蛋白質(zhì)。
　　 6.蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，rhFGF-21處理后ATP合酶活力明顯恢復(fù)，因此對各組細(xì)胞能荷進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)rhFGF-21可顯著恢復(fù)I/RI細(xì)胞的供能。
　　 結(jié)