顱腦創(chuàng)傷后亞低溫腦保護的機制：鈣蛋白酶Calpain及相關(guān)底物MAP-2的研究.pdf

1、大量動物實驗及臨床試驗均證實亞低溫治療能減輕顱腦創(chuàng)傷后病理損害的程度，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，但其保護作用的機制仍未完全明了。其中尚有許多未能徹底闡明或印證的環(huán)節(jié)以及相互作用關(guān)系，而且在亞低溫治療的方法學(xué)上也存在著許多熱點問題，一直也是科學(xué)界研究的重點。其機制研究也由生化、代謝水平深入至分子水平，人們開始從分子水平闡述亞低溫腦保護的作用機制。 Calpain是中樞神經(jīng)半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，通常以沒有活性的酶前體形式存在于神經(jīng)元

2、內(nèi)，胞內(nèi)Ca2+超過一定閾值時可激活此酶。Calpain持續(xù)激活導(dǎo)致蛋白和酶的大量水解。主要集中于它對細胞骨架蛋白，即血影蛋白(Spectrin)、微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)和神經(jīng)絲(Neurofilament)的水解破壞從而參與繼發(fā)性腦損傷。目前，在顱腦外傷模型中，尚無報道亞低溫腦保護治療對Calpain及其作用底物MAP-2的基因或蛋白表達的作用。因此，本實驗將研究顱腦外傷后動物腦組織Calpain及其作用底物MAP-2的基因和

3、蛋白的改變，以及亞低溫腦治療對其產(chǎn)生的影響。 本實驗分為三部分：第一部分：大鼠液壓沖擊腦損傷后亞低溫和常溫模型的建立；第二部分：顱腦外傷后亞低溫治療對Calpain基因和蛋白表達的作用；第三部分：亞低溫對顱腦外傷后大腦組織。 第—部分大鼠液壓沖擊顱腦損傷后常溫和亞低溫治療模型的建立 目的：理想的顱腦損傷動物模型是研究顱腦損傷機制及其診療方法的重要平臺。建立常溫和亞低溫條件下液壓沖擊腦損傷動物模型。評估致傷模型的有

4、效性及傷后腦組織的改變是否符合實驗要求。為深入開展顱腦創(chuàng)傷的相關(guān)動物實驗研究奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)實驗動物及分組：雄性SD大鼠30只，隨機分為：假手術(shù)組(n=10)；液壓腦損傷常溫組(n=10)；液壓腦損傷亞低溫組(n=10)。(2)液壓沖擊腦損傷動物模型建立：實驗動物2％戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉，固定頭部于動物立體定位儀。頭皮正中切口3cm，剝離骨膜，前囟人字縫尖連線中點偏右4mm顱鉆鉆孔，骨窗直徑4.8mm，暴露完整硬腦膜。顱

5、骨固定螺絲兩枚，置入內(nèi)徑2.6mm打擊管，牙科骨水泥牢固固定后縫合消毒頭皮切口。術(shù)后予氣管插管，股動脈置管，動物用多導(dǎo)生理監(jiān)護儀監(jiān)測動物血壓、心率變化。動物出現(xiàn)夾足反應(yīng)時，用液壓腦損傷打擊儀壓力180～200 kPa造成中度腦損傷。手術(shù)過程用溫度計及腦溫儀監(jiān)測肛溫和顳肌溫度。假手術(shù)組同樣行顱骨鉆孔和埋管處理，但未遭受打擊損傷。(3)亞低溫治療的實施：亞低溫組腦損傷后將動物置于降溫毯上，30min內(nèi)腦溫及肛溫降至32℃～33℃，應(yīng)用加熱墊

6、及冰袋維持亞低溫4h。常溫組傷后保持體溫(37±0.3℃)4h。(4)指標(biāo)檢測和采集：各組均進行生命體征監(jiān)測、神經(jīng)行為學(xué)評分、大體標(biāo)本觀測和病理切片觀察。研究標(biāo)本采用低溫下取大鼠受傷大腦皮層周圍組織，液氮保存。 結(jié)果：結(jié)果顯示，各組大鼠成功建立液壓腦損傷及亞低溫模型，常溫組傷后維持體溫(37±0.3℃)4h，亞低溫組維持體溫(32.5±0.5℃)4h。通過損傷前后表現(xiàn)及病理生理功能的監(jiān)測，證實致傷裝置能導(dǎo)致大鼠致傷后出現(xiàn)明顯的改

7、變，尤其損傷早期各指標(biāo)變化明顯，病理形態(tài)學(xué)顯示中度腦損傷改變。亞低溫過程中大鼠動脈血壓、心率、呼吸等指標(biāo)基本保持正常范圍。 結(jié)論：實驗結(jié)果顯示，該動物模型與臨床上接受亞低溫治療的顱腦損傷患者的病理學(xué)改變和病理生理特點極其相似，符合實驗要求。我們成功地建立了大鼠常溫和亞低溫顱腦損傷模型，為下一步亞低溫腦保護機制的研究提供了良好條件。 第二部分：顱腦外傷后亞低溫治療對Calpain基因和蛋白表達的作用 目的：Calpai

8、n是中樞神經(jīng)半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，Calpain主要集中于它對細胞骨架蛋白，即血影蛋白(Spectrin)、微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)和神經(jīng)絲(Neurofilament)的水解破壞從而參與繼發(fā)性腦損傷。亞低溫治療對Calpain活性的影響尚未完全闡明。本研究立足于探討亞低溫治療對顱腦外傷后Calpain基因和蛋白表達的影響。 方法：將27只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=3)，常溫腦損傷組(n=12)和亞低溫腦損傷組(

9、n=12)。腦損傷組分別接受右頂部側(cè)方中度液壓損傷打擊(FPI)，其中亞低溫組在傷后即刻接受持續(xù)4小時的亞低溫治療(肛溫32±0.5℃)。在傷后6h、12h、24h和72h四個時間點分別處死3只常溫和亞低溫損傷組大鼠，通過熒光PCR、Westernblot半定量檢測各組打擊傷灶周圍皮質(zhì)鈣蛋白酶Calpain基因轉(zhuǎn)錄和蛋白分子表達的水平，同時運用免疫熒光觀察Calpain蛋白分布情況。 結(jié)果：與常溫組比較，亞低溫使顱腦外傷后12h

10、及24hCalpain基因的轉(zhuǎn)錄較正常對照和同時間點常溫腦損傷組顯著增加(P<0.05)；但是，傷后6h、12h、24h和72h亞低溫治療均使Calpain在蛋白分子水平較同時間點常溫腦損傷組表達升高的程度顯著抑制(P<0.05)。 結(jié)論：實驗結(jié)果顯示，鈣蛋白酶Calpain活性及其蛋白水解作用，在顱腦創(chuàng)傷后級聯(lián)反應(yīng)的中起著重要作用。亞低溫療法能明顯抑制其表達。亞低溫治療的腦保護機制可能通過抑制Calpain蛋白分子的表達，參與

11、與抑制細胞內(nèi)Calpain的蛋白水解作用有關(guān)。 第三部分亞低溫對顱腦外傷后大腦組織MAP-2基因和蛋白表達的影響 目的：亞低溫的腦保護機制尚未完全明了，本研究探討亞低溫治療對顱腦外傷后大腦組織MAP-2基因和蛋白表達的影響。 方法：將27只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=3)，常溫腦損傷組(n=12)和亞低溫腦損傷組(n=12)，損傷組分別接受右頂部側(cè)方中度液壓損傷打擊(FPI)，其中亞低溫腦損傷組在傷后即刻接受持

12、續(xù)4小時的亞低溫治療(肛溫32±0.5℃)，在傷后6h，12h，24h和72h分別處死3只常溫和亞低溫腦損傷組大鼠，通過熒光PCR、Westernblot半定量檢測各組大腦半球打擊傷灶周圍皮質(zhì)MAP-2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白分子的表達水平。 結(jié)果：顱腦外傷后各組MAP-2基因轉(zhuǎn)錄均下降，而亞低溫治療使6h，12h和24h MAP-2基因的轉(zhuǎn)錄較同時間點常溫腦損傷組明顯增加(p<0.05)。常溫腦損傷組6h、12h及72h MAP-2蛋白

13、的表達都較正常對照組顯著增加(p<0.05)，6h及12h亞低溫腦損傷組MAP-2蛋白表達也較正常對照組顯著增加(p<0.05)，而24h亞低溫腦損傷組則較正常對照組表達下降(P<0.05)。 結(jié)論：(1)顱腦外傷后亞低溫治療可直接影響MAP-2的基因轉(zhuǎn)錄或蛋白表達，亦可能通過調(diào)節(jié)鈣蛋白酶Calpain表達而間接作用于MAP-2蛋白分子的表達。(2)本實驗證明，亞低溫不僅抑制鈣蛋白酶Calpain的活性表達，而且還能減少其作用底