亞低溫對顱腦創(chuàng)傷后受體相互作用蛋白激酶-1及其壞死性凋亡通路表達影響的實驗研究.pdf

1、研究目的：本實驗利用可控性皮質損傷裝置（CCI）裝置成功建立大鼠顱腦創(chuàng)傷模型，及可控性細胞損傷裝置（CIC-II）裝置成功建立顱腦創(chuàng)傷的細胞模型并運用此模型進行：(1)探討亞低溫對顱腦創(chuàng)傷（TBI）后大鼠腦組織受體相互作用蛋白激酶-1（RIPK-1）表達的影響。（2）對RIPK-1介導的壞死性凋亡通路中神經細胞壞死性凋亡的分子機制進行探索并揭示重要蛋白在通路中的相互作用。（3）研究亞低溫對壞死性凋亡通路保護作用的分子機制。（4）FADD

2、在RIPK-1介導的壞死性凋亡通路中的作用。
　　研究內容與方法：本實驗分為兩個部分：即動物實驗部分和細胞實驗部分。實驗一：利用可控性皮質損傷裝置（CCI）建立大鼠顱腦創(chuàng)傷模型并給予多種方法系統(tǒng)評價造模準確性。實驗二：應用可控性細胞損傷裝置（CIC-II）裝置成功建立顱腦創(chuàng)傷的細胞模型并就細胞形態(tài)學等特征進行系統(tǒng)評價研究。
　　實驗一：健康成年Wistar大鼠40只，將其隨機分成4組：Sham組（假手術）開骨窗不予打擊、傷后

3、不給予亞低溫治療，Sham+HT組（假手術+亞低溫）開骨窗不予打擊而后亞低溫干預8小時，TBI組（手術）開骨窗后應用CCI裝置打擊致傷，參數設置為：速率（v）4m/s，深度（d）2mm，持續(xù)時間（t）120ms， TBI+HT組（手術+亞低溫）開骨窗，CCI打擊致傷（前后打擊參數保持一致），傷后采取亞低溫治療時間統(tǒng)一定為8小時，待動物蘇醒后，在傷后1天和2天進行神經功能缺陷綜合評分（n=10），后進行親神經特殊染料（甲苯胺藍）的腦組織染

4、色實驗；Western-blot測定大鼠皮層 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, TRAIL, and FasL的表達；Real-time PCR測定大鼠皮層 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, TRAIL, and FasL的mRNA表達；腦組織HE染色、免疫組化染色；腦組

5、織DNA免疫熒光實驗；透射電子顯微鏡檢測腦組織壞死后亞細胞結構變化；Fluoro-Jade.C(FJC)腦組織染色；大鼠腦組織血流量測定。
　　實驗二：SH-SY5Y人神經母細胞瘤細胞的培養(yǎng)，應用 CIC-II梯度打擊SH-SY5Y并評價，常規(guī)培養(yǎng)胰酶消化SH-SY5Y細胞，準備生物硅膠模培養(yǎng)皿，每個生物硅膠模培養(yǎng)孔內加入2ml細胞懸液，混勻，置入培養(yǎng)皿內培養(yǎng)24h，以使之貼壁生長，次日取出生物硅膠模培養(yǎng)皿，置于 CIC-II儀器

6、之下，第一孔不打擊，其余各孔各打擊1-4次，打擊中不間隔；在每孔中分別加入FJC、PI、DAPI行免疫熒光染色，觀察細胞形態(tài)學變化及細胞死亡情況；SH-SY5Y細胞分為四組，接種于6孔板。分別為假手術組（Sham組）：不予CIC-II打擊、傷后不給予亞低溫干預，假手術組+亞低溫組（Sham+HT組）：不予CIC-II打擊、傷后亞低溫干預8小時，手術組（TBI組）： CIC-II打擊、傷后不予亞低溫干預，手術組+亞低溫組（TBI+HT組）

7、：CIC-II打擊、傷后給予亞低溫干預8小時，次日取出四組細胞，處理后流式細胞儀分析檢測。
　　結果：1.傷后24h、48h神經功能評分結果：TBI+HT組較TBI組NSS評分明顯降低（P<0.01）。本實驗提示HT治療能改善顱腦創(chuàng)傷大鼠的神經功能缺陷癥狀，且隨時間延長，低溫干預的遠期療效呈增加態(tài)勢（*P＜0.05，**P＜0.01）；（＃＃P＜0.05）。
　　2. Real-time RT-PCR驗證大鼠腦組織目的基因表

8、達情況：
　　根據 Real-time RT-PCR結果顯示各組 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, TRAIL, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL相對表達量：與Sham組相比，其余各組大鼠腦組織中目的基因 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, TRAIL, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL mRNA表

9、達量均有不同程度的增加；TBI組及TBI+HT組mRNA表達量較假手術組明顯增加，且差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05，**P＜0.01）； TBI組及TBI+HT組相比，亞低溫干預后，TBI+HT組大鼠腦組織中目的基因 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, TRAIL, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL mRNA表達量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05，**P＜

10、0.01）。
　　3. Western-blot實驗結果:
　　與Sham組相比，余大鼠腦組織中RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, TRAIL, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL表達量均有不同程度的增加；TBI組及TBI+HT組目的蛋白表達量較假手術組明顯增加，且差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05，**P＜0.01）； TBI+HT組大鼠腦組織中目的蛋白RIP

11、K-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, TRAIL, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL表達量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05，**P＜0.01）。
　　4.透射電鏡觀察大鼠TBI造模后神經元胞核及線粒體結構:
　　Sham組腦組織超微結構中的線粒體和胞核未見明顯異常改變，TBI組的神經細胞變化主要有細胞核型不規(guī)則，胞漿內網狀組織腫脹，胞漿減少，核內染色質邊集

12、等壞死和凋亡的特征性改變線粒體密集成簇，出現馬蹄形或環(huán)形扭曲，線粒體膜產生細小空泡，內部線粒體嵴結構崩解消失。
　　5. HE染色觀察大鼠皮層及海馬神經細胞：
　　TBI組可見不同程度損傷，皮層損傷區(qū)含有大量紅細胞，在 Sham組及Sham+HT組，神經細胞結構及數目無明顯異常；在TBI組，皮層及海馬部位神經細胞有損壞性改變。在TBI+HT組，紅細胞數目在皮層損傷區(qū)域有明顯降低，神經細胞結構及功能損壞不明顯。
　　6.

13、 FJC染色陽性細胞評價TBI大鼠造模后神經元變性壞死：
　　本實驗中，應用FJC染色TBI后大鼠腦組織切片有明確陽性發(fā)現。FJC染色陽性部位切片可見多個綠染神經元細胞，未行CCI打擊的大鼠腦組織FJC染色未見明顯陽性發(fā)現，這種綠染的陽性神經細胞在皮質損傷周邊區(qū)域更加明顯，數量也較多。
　　7.大鼠腦組織免疫組織化學染色及腦組織內 TRAIL+PARP-1+DNA免疫熒光三染結果：
　　觀察區(qū)域為大鼠損傷側皮層， RI

14、PK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8免疫陽性產物主要定位于神經元胞質內；TNF-α, and FasL免疫陽性產物主要定位于神經元胞膜。Sham組和 Sham+HT組中 RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL免疫陽性產物較創(chuàng)傷組表達量低，TBI組中RIPK-1, RIPK-3, FA

15、DD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL免疫活性明顯增加，而與TBI組比較，TBI+HT組中RIPK-1, RIPK-3, FADD, PARP-1, Caspase-3, Caspase-8, TNF-α, and FasL免疫活性則有不同程度上的降低。PARP-1熒光陽性區(qū)域與DAPI重疊，提示 PARP-1為胞核內表達，TRAIL免疫銀光染色陽性區(qū)域集中于神經細胞包膜。

16、r>　　8.多普勒超聲腦血流量檢測結果：
　　TBI干預后使得大鼠損傷周邊血流量(TBI組及TBI+HT組)與Sham組相比顯著下降（**P＜0.01），在TBI造模后給予亞低溫干預后，復測大鼠腦血流量，結果顯示：與 TBI組大鼠腦血流量相比，打擊損傷周邊區(qū)域皮質的腦血流量有所增加，組間比較增加的腦血流量有統(tǒng)計學意義（**P＜0.01）。
　　9.應用CIC-II梯度打擊SH-SY5Y細胞形態(tài)學觀察及PI免疫熒光染色：

17、>　　對照組細胞形態(tài)基本保持不變，隨打擊次數的增加，死亡細胞數量逐漸增多，此外，CIC-II打擊后的SH-SY5Y細胞胞體變小、變圓，伸出的軸突縮短，樹突樣突起數目減少，單個細胞形態(tài)更為多樣化，提示細胞處于壞死、凋亡期，且隨打擊次數增加，這種趨勢更為明顯，進一步的PI免疫熒光染色結果補充證明這一現象，說明應用CIC-II打擊SH-SY5Y細胞可以良好的復制體外TBI模型。10.應用激光全息細胞成像系統(tǒng)（SUN-BIO M3）觀察記錄SH

18、-SY5Y各參數及PI染色應用流式細胞術觀察記錄SH-SY5Y凋亡周期：
　　應用 SUN-BIO M3觀察記錄 SH-SY5Y細胞參數可供研究分析細胞物理特性，隨打擊次數增加，細胞死亡率呈現增加趨勢；細胞平均突起增多；細胞變得更加粗糙，后又規(guī)則以及細胞平均形狀凸率先下降又升高，細胞文理變得雜亂不規(guī)則，細胞平均厚度增加提示細胞皺縮，體積不變情況下，單個細胞厚度增加；細胞平均周長變短，細胞平均不規(guī)則度下降，提示細胞突起減少，細胞匯合

19、度明顯下降，組間比較增加、減少值有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05、**P＜0.01）11.流式細胞術觀察記錄SH-SY5Y細胞凋亡周期：
　　正常組(control)及正常+亞低溫組(control+HT)細胞有少量調亡，G1峰形態(tài)無明顯提前，在應用CIC處理過的細胞應用PI染色流式細胞術觀察記錄SH-SY5Y細胞凋亡周期時可見明顯的G1峰提前，即sub-G1峰，提示SH-SY5Y細胞出現明顯的凋亡壞死趨勢，低溫干預CIC處理過的細胞

20、后，可見G1峰延遲現象得到糾正，無明顯sub-G1峰，凋亡率為(16.8±1.27)％，其中,正常組(control)及正常+亞低溫組(control+HT)細胞調亡率差異無統(tǒng)計學意義，TBI組與TBI+HT組相比，調亡率差異有統(tǒng)計學意義(*P＜0.05)，應用亞低溫干預可以明顯保護細胞免受損傷。
　　結論：實驗得出以下三個結論：（1）外傷后的RIPK-1表達量呈現增加趨勢，在用于亞低溫這一干預手段之后可以顯著降低TBI大鼠RIP