亞低溫聯(lián)合促紅細胞生成素(EPO)對顱腦創(chuàng)傷后β-淀粉樣蛋白(Aβ)表達影響的體內(nèi)體外研究.pdf

1、目的：擬通過檢測β-淀粉樣蛋白(Aβ)在臨床顱腦創(chuàng)傷(TBI)患者體液中表達量的改變，證實其參與TRI的進展；構(gòu)建pIRES2-EGFP-APP重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SH-SY5Y-APP細胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達Aβ的細胞模型，采用亞低溫干預手段，證實該措施對細胞創(chuàng)傷起一定程度的保護作用；在此基礎上回歸體內(nèi)試驗，常規(guī)建立液壓顱顱腦創(chuàng)傷模型，除給予亞低溫保護性干預外，應用促紅細胞生成素(EPO)及其與亞低溫聯(lián)合干預，觀察治療效果，尋找顱腦創(chuàng)傷的新的

2、治療靶點，為臨床早期干預尋找新的方向。
　　方法：本課題分為三部份，第一部分：通過對60例小樣本的臨床病例進行檢測，分別于患者入院后第0h、24h、48h、72h留取CSF、外周血，ELISA方法檢測Aβ含量，并采用GCS評分標準判斷預后評估，檢測Aβ在腦脊液及血清中的變化與預后的相關(guān)性。第二部分：構(gòu)建pIRES2-EGFP-APP重組表達載體，常規(guī)培養(yǎng)SH-SY5Y細胞系，細胞狀態(tài)穩(wěn)定后進行轉(zhuǎn)染，western-blot方法檢測

3、細胞蛋白中APP是否表達及表達量高低，構(gòu)建穩(wěn)定表達APP的細胞模型；并在此基礎上給予常溫及亞低溫培養(yǎng)，檢測不同溫度條件下細胞生長情況。第三部分：制備液壓顱顱腦創(chuàng)傷模型，大鼠造模結(jié)束后采用冰袋包裹頭部以下部位，30分鐘內(nèi)將體溫降至31℃保持溫度波動于31-33℃，5小時；其后將體溫升至37.5-38.5℃。rhEPO組大鼠致傷后即刻及每天腹腔內(nèi)注射(5000IU/kg)rhEPO，術(shù)后每12h肌注青霉素鈉40萬U。分別于手術(shù)后0.5h、2

4、h、6h、12h、24h、48h、72h，ELISA方法檢測血清及腦脊液中Aβ含量，病理檢查觀察TBI模型腦組織創(chuàng)傷情況，western-blot檢測不同干預方式腦組織中Aβ表達。
　　結(jié)果：第一部分實驗通過對小樣本的臨床病例的體液標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷患者術(shù)后Aβ隨時間改變逐步升高，其機制涉及顱顱腦創(chuàng)傷可致神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞創(chuàng)傷，血腦屏障破壞，進而使得崩解的細胞骨架中的AB進入腦脊液及血液循環(huán)，其表達水平與創(chuàng)傷程度呈正相關(guān)。第

5、二部分的研究結(jié)合臨床檢驗的結(jié)果，選用真核表達載體pIRES2-EGFP來轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞系，基于細胞標記示蹤理論依據(jù)，并借助該實驗手段對細胞株進行反復篩選，從而獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并大量表達APP的細胞系。通過Western-blot進一步證明了APP基因在轉(zhuǎn)染細胞系內(nèi)穩(wěn)定表達。并給予細胞株常溫培養(yǎng)及亞低溫培養(yǎng)兩種不同的干預措施，證實亞低溫對細胞創(chuàng)傷起一定程度的保護作用。第三部分進行了體內(nèi)模型的構(gòu)建和研究，成功構(gòu)建了大鼠液壓沖擊顱顱腦創(chuàng)傷

6、模型，通過神經(jīng)系統(tǒng)評分鑒定了模型的可行性，在此基礎上分別給予亞低溫、EPO、及兩者聯(lián)合干預治療的方式，證實亞低溫聯(lián)合EPO可有效保護顱腦創(chuàng)傷后大腦功能的改變，為進一步深入展開創(chuàng)傷性顱腦的治療提供新的治療靶點及理論依據(jù)。
　　結(jié)論：在常規(guī)治療的同時，采用亞低溫治療可抑制重型顱顱腦創(chuàng)傷患者的Aβ的表達及ICP水平并提高患者預后，Aβ作為一種新生物標記物，其動態(tài)變化與顱顱腦創(chuàng)傷創(chuàng)傷程度有一定相關(guān)性，Aβ含量變化作為患者預后一項評定指標。