紅細(xì)胞生成素(EPO)與甲潑尼龍(MPSS)聯(lián)合應(yīng)用對損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞影響的研究.pdf

1、第一部分大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：采用新生大鼠大腦皮質(zhì)制作原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定和細(xì)胞純度測定
　　 方法：使用出生后3天內(nèi)的SD乳鼠(圖1)大腦皮質(zhì)制成細(xì)胞懸液后，按107～109/L個(gè)細(xì)胞接種于已用0.01％多聚左旋賴氨酸包被好的底面積為75 cm2培養(yǎng)瓶中，放置于培養(yǎng)箱(圖2)中(5％CO2，37℃)培養(yǎng)，采用含15％的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)7-10 d，通

2、過差速貼壁和不同速度的搖床(圖3)及逐漸傳代純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，通過GFAP免疫熒光染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過對比GFAP陽性細(xì)胞與DAPI染色細(xì)胞核測定細(xì)胞純度。
　　 結(jié)果：使用差速貼壁法與搖床技術(shù)相結(jié)合可獲得高純度星形膠質(zhì)細(xì)胞，并傳代純化，細(xì)胞的形態(tài)逐漸發(fā)生變化，培養(yǎng)的細(xì)胞GFAP染色呈陽性，顯示正常星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體多呈三角形，胞膜光滑，邊界清晰，胞突較長(圖19、20)，熒光染色顯示GFAP陽性細(xì)胞占總

3、細(xì)胞數(shù)比例在95％以上(圖11、12)。
　　 結(jié)論：通過新生乳鼠大腦皮質(zhì)制作原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，使用差速貼壁法與搖床技術(shù)培養(yǎng)后可獲得高純度的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 第二部分大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞缺營養(yǎng)損傷模型制作
　　 目的：制作理想的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷模型，觀察形態(tài)變化，檢測細(xì)胞損傷前后統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性
　　 方法：純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞，采用PBS緩沖液代替培養(yǎng)基模擬脊髓缺血損傷模型(缺營養(yǎng))，缺營養(yǎng)3小時(shí)后更

4、換正常培養(yǎng)基恢復(fù)營養(yǎng)。(1)、倒置顯微鏡(圖4)觀察細(xì)胞缺營養(yǎng)前后形態(tài)變化；(2)、MTT(圖5)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性；(3)、PCR(圖6)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)、缺營養(yǎng)3小時(shí)后部分細(xì)胞胞體變小，胞突變短，個(gè)別細(xì)胞脫落，呈圓形?；謴?fù)營養(yǎng)后細(xì)胞胞體變大，胞突變長并相互交錯(cuò)，基本恢復(fù)缺營前形態(tài)，仍然可見少數(shù)死亡細(xì)胞漂浮在貼壁細(xì)胞層面上；(2)、MTT示：損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性降低，恢復(fù)

5、培養(yǎng)基后細(xì)胞增殖活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(3)、PCR檢測示：星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后AQP4表達(dá)降低，恢復(fù)培養(yǎng)基后AQP4表達(dá)升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：通過上述方法模擬脊髓缺血損傷，原代星形膠質(zhì)細(xì)胞缺營養(yǎng)后可耐受一定的損傷，恢復(fù)營養(yǎng)后可基本恢復(fù)至損傷前的形態(tài)，MTT、PCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷前后差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第三部分 EPO對星形膠質(zhì)細(xì)胞的AQP4 mRNA表達(dá)的作用
　　 目的

6、：研究EPO(Erythropoietin)對體外培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞缺營養(yǎng)3 h后aquaporin4(AQP4)mRNA表達(dá)的作用。
　　 方法采用出生三天內(nèi)的SD大鼠大腦皮層制成單細(xì)胞懸液后，應(yīng)用含15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)，通過差速貼壁、搖床和傳代純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP免疫熒光鑒定細(xì)胞，通過PBS緩沖液代替培養(yǎng)基模擬缺營養(yǎng)模型3小時(shí)后即刻應(yīng)用促EPO(10 u/l)然后按照加入藥物0.5 h、1 h、1.5

7、 h、2 h、3 h、6 h、12 h、18 h收集細(xì)胞。PCR技術(shù)測定細(xì)胞AQP4 mRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：星形膠質(zhì)細(xì)胞缺營養(yǎng)三小時(shí)AQP4表達(dá)降低；EPO作用0.5 h后細(xì)胞AQP4mRNA表達(dá)較正常生理鹽水對照組明顯升高(圖14、15)。
　　 結(jié)論：EPO作用0.5 h后對損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 mRNA表達(dá)有顯著作用。
　　 第四部分 EPO與MPSS聯(lián)合應(yīng)用對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4

8、 mRNA表達(dá)的研究
　　 目的 EPO與MPSS(Methylprednisolone)聯(lián)合應(yīng)用對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，并探討其對脊髓缺血水腫損傷的作用機(jī)制。
　　 方法體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞傳至第三代，免疫熒光顯微鏡鑒定細(xì)胞種類，在PBS液中作用3 h后，建立星形膠質(zhì)細(xì)胞缺營養(yǎng)損傷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；給予DMEM/F12培養(yǎng)基加15％胎牛血清恢復(fù)營養(yǎng)，然后按生理鹽水對照組、MPSS(10 ug/ml)組、EPO(10u

9、/ml)組、MPSS(10 ug/ml)和EPO(10 ug/ml)組、EPO(5 ug/ml)和MPSS(5 ug/ml)組的劑量干預(yù)，干預(yù)后分別于0.5 h、1 h、1.5 h、2 h收集細(xì)胞；觀察：(1)、光鏡觀察不同干預(yù)組合對星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)影響；(2)、應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測定細(xì)胞活性；(3)、使用RT-PCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 mRNA表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：(1)、缺營養(yǎng)可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞

10、增殖，恢復(fù)培養(yǎng)基后細(xì)胞形態(tài)均有恢復(fù)；(2)、單獨(dú)應(yīng)用EPO對細(xì)胞增殖恢復(fù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，單獨(dú)MPSS對損傷細(xì)胞增殖恢復(fù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(3)、EPO和MPSS聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞增殖恢復(fù)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(4)、生理鹽水對照組對細(xì)胞增殖無明顯作用；(5)、半量EPO和半量MPSS聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞增殖恢復(fù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(6)、單獨(dú)EPO和單獨(dú)MPSS均促進(jìn)損傷細(xì)胞AQP4 mRNA表達(dá)增加；(7)、聯(lián)合應(yīng)用EPO和MPSS對細(xì)胞AQP4 mRNA表達(dá)