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文檔簡介
1、研究背景和目的: 急性脊髓損傷(Actlte spinal cord injury,ASCI)仍然是嚴重危害人類健康的常見疾病。現(xiàn)代社會的交通運輸業(yè)、建筑業(yè)、體育運動等發(fā)展迅速,因此而導致的急性脊髓損傷病例也隨之增多。僅美國每年新發(fā)脊髓損傷病例就有大約11000例,每百萬人口里有40例。據(jù)估計我國每年約有50000人發(fā)病,呈10﹪的上升趨勢。脊髓損傷一旦發(fā)生,視傷時輕重不同,將導致患者不同程度的肢體殘疾。除了給患者本身帶來巨大的
2、痛苦,加重社會及康復機構(gòu)人力、物力及財力的負擔,脊髓損傷還增加了患者、家庭以及朋友的心理負擔。 急性脊髓損傷至今仍缺乏行之有效的治療措施。ASCI的治療仍然是醫(yī)學研究的一大難題。新千年的第一個十年(2001-2010)被稱為“脊柱十年”,目的在于深化我們對于脊柱疾病,包括脊髓損傷,的認識并提高治療效果。在眾多治療措施中,藥物治療仍然是目前ASCI的研究熱點之一。近年來,促紅細胞生成素(Erythropoietin,EPO)引起了
3、國內(nèi)外學者的廣泛關注。 長期以來,人們認為EPO作為一種激素,僅僅作用于紅骨髓,促進紅系造血祖細胞增殖、分化。重組人紅細胞生成素(Recombinant human erythropoietin,rHlJEPO)被廣泛應用于治療腎功能衰竭、HIV感染、癌癥和外科手術等引起的貧血。但近十余年的報道提示,EPO是多效應的細胞因子,對多種組織起到保護作用,如心肌細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞、腎臟管狀上皮細胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central
4、nervous system,CNS)等。 EPO的神經(jīng)保護功效已經(jīng)在多種動物的多種CNS疾病模型中得到驗證。如腦缺血模型、蛛網(wǎng)膜下腔血腫模型、實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型及脊髓損傷模型等。其中,EPO用于脊髓損傷的研究相對較少,多集中于近4-5年,且給藥時間多為損傷后短時間內(nèi)給藥。而Rrines等認為rHuEPO在腦缺血的治療上存在時間窗。我們認為rHuEPO在用于ASCI也同樣存在一定的時間窗。本課題擬分兩部分研究rHuEP
5、O對大鼠急性脊髓損傷后的神經(jīng)功能保護作用。 第一部分:在大鼠脊髓損傷后分不同時間給予一定量rHuEPO,通過觀察脊髓損傷后神經(jīng)細胞凋亡情況及BBB運動評分,以此對于rHuEPO治療ASCI的時間窗進行初步的研究。為進一步實驗及臨床研究rHuEPO的時間窗提供一定的理論依據(jù)和技術方法。 第二部分:根據(jù)第一部分實驗結(jié)果,選取最佳給藥時間,給予一定量rHuEPO,通過行為學觀察和組織病理學觀察指標來研究rHuEPO治療大鼠急性
6、脊髓損傷的長期效果。 第一部分大鼠脊髓損傷后不同時間注射重組人紅細胞生成素對運動功能及神經(jīng)細胞凋亡的影響研究方法40只雌性大鼠脊髓血管夾夾傷模型(aneurysm clip model)成功后,隨機均分為5組,每組8只。A組(即刻給藥組):大鼠脊髓損傷(SCI)后立即腹腔注射rHuEPO(5000IU/Kg/Bw);B組(1小時給藥組);C組(3小時給藥組);D組(6小時給藥組);E組(對照組):SCI后立即腹腔注射等量生理鹽水
7、。各組大鼠術后第1、3、5、7d進行BBB運動學評分。選取術后第3天和第7天為取材時問點,各組每時間點各取4只。行TUNEL染色和caspase-3免疫組化染色,觀察各組在術后第3天和第7天脊髓神經(jīng)細胞凋亡的表現(xiàn)。 結(jié)果 總體上EPO各給藥組的BBB評分較對照組高。但不同給藥組之間出現(xiàn)了一定差異。第3天6h給藥組的BBB評分和對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 而第7天的時候,雖然6h給藥組的評分高于對
8、照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),但是與即刻給藥組、1h給藥組和3h給藥組相比,6h給藥組的評分較低,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 TUNEL染色結(jié)果顯示在傷后第3天和第7天這兩個時間點上,給藥的四組凋亡細胞數(shù)均較對照組為少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。但在傷后第3天,可以看出6h給藥組凋亡細胞數(shù)比1h給藥組的多,且差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在傷后第7天,立即給藥組、1h給藥組和3h給藥組的凋亡細胞數(shù)比6h
9、給藥組的少,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中立即給藥組和3h給藥組的凋亡細胞數(shù)比6h給藥組的少,差異存在顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Caspase-3免疫組合染色結(jié)果顯示各治療組均較對照組的凋亡細胞陽性率為低,且差異有統(tǒng)計學意義(F<0.01)。但在傷后第3天,6h給藥組的凋亡細胞陽性率較即刻給藥組、1h給藥組和3h給藥組的高,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中,6h給藥組的凋亡細胞陽性率與即刻給藥組和3h給藥組的差異
10、存在顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 結(jié)論 1.rHuEPO具有神經(jīng)功能保護功效??梢愿纳拼笫蠹顾钃p傷后運動功能恢復情況,并抑制傷后脊髓神經(jīng)細胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。 2.大鼠急性脊髓損傷后3h內(nèi)給予rHuEPO可顯著改善其后肢運動功能并抑制細胞凋亡。而延遲到傷后6h給予rHuEPO,收效甚微。 第二部分重組人紅細胞生成素治療大鼠急性脊髓損傷的實驗研究研究方法50只雌性大鼠脊髓血管夾夾傷模型成功后,隨機分至3組
11、:rHuEPO組,20只;生理鹽水組,20只;假手術組,10只。通過BBB運動評分觀察各組大鼠后肢運動功能恢復情況;組織病理學選擇HE和抗GFAP、Nogo-A和NelJN免疫組化染色的方法評價rHuEPO對于ASCI的保護及修復作用。 結(jié)果 術后第1周開始各觀察點上rHuEPO組的BBB評分即高于生理鹽水組(P(0.01)。 生理鹽水組GFAP的陽性面積明顯高于rHuEPO組,且各觀察點的差異均存在顯著性統(tǒng)計學
12、意義(P(0.01)。而rHuEPO組和假手術組相比,雖然各觀察點前者均值均較高,但除了在第6周時差異有統(tǒng)計學意義(P(0.01),其余觀察點兩者差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 各觀察點上,rHuEPO組的Nogo-A表達光密度均低于生理鹽水組,且差異有顯著性統(tǒng)計學意義(P(0.01)。 各觀察點上,生理鹽水組NeuN染色陽性細胞數(shù)均明顯少于rHuEPO組,差異均存在顯著統(tǒng)計學意義(P(0.01)。 結(jié)論
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