重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠視神經(jīng)不完全損傷的保護(hù)研究.pdf

1、目的：外傷性視神經(jīng)病變(traumatic optic neuropathy，TON)是外力經(jīng)眶骨傳導(dǎo)的對(duì)視神經(jīng)(optic nerve，ON)的間接損傷。損傷后可以沒有外部或最初眼底鏡下的視神經(jīng)損傷的表現(xiàn)，卻常常導(dǎo)致暫時(shí)或永久性的視力障礙。損傷的確切機(jī)制及病理過程尚不清楚。目前臨床還沒有確鑿的治療方案，療效欠佳。目前神經(jīng)生長因子、抗氧化劑、谷氨酸受體拮抗劑等神經(jīng)保護(hù)劑在視神經(jīng)損傷治療的應(yīng)用大多還僅現(xiàn)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 本實(shí)驗(yàn)通過建立

2、外傷性視神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型，早期應(yīng)用重組人促紅細(xì)胞生成素(recombanant humanervthropoietin,rhEPO)，設(shè)立對(duì)照組，觀察大鼠視網(wǎng)膜(retinal ganglion RG)和ON形態(tài)，檢測(cè)生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)及GAP-43mRNA的表達(dá)，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論和依據(jù)，旨在探討治療視神經(jīng)損傷的新方法。 方法：選用清潔級(jí)健康成年S

3、D大鼠126只，雌性，體重230g-250g，外眼及眼底檢查正常。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(6只12眼)，損傷對(duì)照組(60只60眼)即視神經(jīng)鉗夾十生理鹽水組，EPO治療組(60只60眼)即視神經(jīng)鉗夾十EPO組三組。損傷對(duì)照組和EPO治療組再按損傷后存活的時(shí)間隨機(jī)分為1天，4天，7天和14天，28天5組。損傷組與治療組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各12只眼。除正常對(duì)照組外，每只動(dòng)物均為左眼ON損傷，右眼不損傷。各時(shí)間點(diǎn)和正常對(duì)照組的12只眼中，3只用于制作RG和

4、ON切片，進(jìn)行HE染色后光鏡下RG形態(tài)學(xué)變化的觀察及計(jì)數(shù)和ON形態(tài)觀察、3只用于制作ON電鏡切片，進(jìn)行醋酸鈾和構(gòu)椽酸鉛雙重染色后電鏡下行視ON形態(tài)觀察和軸突計(jì)數(shù)，6只用于制作ON冰凍切片和ON總RNA提取，分別行視神經(jīng)組織GAP-43和GAP-43mRNA定性和半定量的檢測(cè)。用壓力恒定的反向鑷，于球后2mm處夾持視神經(jīng)20s，制作ON損傷動(dòng)物模型。治療組于損傷后立即用消毒后的10μL微量推進(jìn)器吸取藥物，向玻璃體腔內(nèi)注射rhEPO 2μL

5、，即200ng/眼，對(duì)照組玻璃體腔內(nèi)注射生理鹽水2μL。各組動(dòng)物在達(dá)到預(yù)定存活時(shí)間后，完整摘出眼球和ON，制備RG和ON切片，分別進(jìn)行光鏡及電鏡下觀察和計(jì)數(shù)，和采用免疫組織化學(xué)方法及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)從蛋白水平及分子水平檢測(cè)在不同處置方法后不同的恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)ON軸突中GAP-43及其mRNA表達(dá)及程度。所有數(shù)據(jù)資料錄入微機(jī)，用SPSS(10.0)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，集中趨勢(shì)及離散趨勢(shì)述用均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差描述，單因素多組

6、間的比較用單因素方差分析，單因素兩組間比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α=0.05)。 結(jié)果：1 染色的RG切片形態(tài)觀察和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglion cell，RGC)計(jì)數(shù)：ON損傷后1、4天，三組比較病理形態(tài)和RGCs數(shù)目無明顯改變。7、14、28天，損傷組，治療組同正常對(duì)照組相比，可見RGCs層部分胞核體積縮小，染色加深，呈核固縮形態(tài)，數(shù)量較正常組減少，呈現(xiàn)加重趨勢(shì)。7、14和28天治療組的RG病理改變較同時(shí)間

7、點(diǎn)損傷組明顯減輕。 1天、4天時(shí)，三組RGCs個(gè)數(shù)差異無顯著性(p＞0.05)；治療組7天、14天和28天RGCs個(gè)數(shù)均高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)損傷組，差異有顯著性(p＜0.05)。4天、7天、14天和28天兩組RGCs數(shù)均隨時(shí)間推移遞減，差異有顯著性(P＜0.05)。 2.HE染色的ON切片形態(tài)學(xué)觀察： 損傷組：1天ON纖維束腫脹，散在神經(jīng)纖維空泡變性。4天纖維束腫脹加重，神經(jīng)纖維空泡變性。7天纖維束腫脹，片狀神經(jīng)纖維空泡變性。

8、14天纖維束腫脹，大片神經(jīng)纖維空泡變性，大空泡形成。28天纖維束腫脹稍減輕，大片神經(jīng)纖維空泡變性，較多大空泡。損傷1天后治療組較損傷組病變無明顯差異，4天、7天、14天、28天治療組較損傷組病變明顯減輕，神經(jīng)纖維空泡變性減少，纖維束腫脹較輕。 3.ON超微形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)數(shù)3.1 形態(tài)學(xué)超微觀察： 損傷組：可見多數(shù)軸突呈現(xiàn)低電子密度，軸突內(nèi)結(jié)構(gòu)呈顆粒狀變性，部分軸突內(nèi)可見線粒體明顯腫脹和空泡化，部分軸突的軸膜與髓鞘間有間隙

9、形成，髓鞘松解，結(jié)構(gòu)紊亂，軸漿內(nèi)空泡形成，微管、微絲、線粒體明顯減少或消失。 治療組：也可見到軸漿呈現(xiàn)低電子密度，顆粒狀變性等征象，但軸漿內(nèi)線粒體腫脹程度較損傷組明顯減輕，線粒體、微管、微絲較損傷組明顯增多，髓鞘排列整齊，層次清晰，脫髓鞘較輕。 3.2 超微觀察計(jì)數(shù)損傷后1天三組軸突數(shù)目無明顯差異。4天、7天、14天、28天時(shí)治療組軸突數(shù)均高于同時(shí)間點(diǎn)損傷組，差異有顯著性(p＜0.05)；兩組軸突隨時(shí)間推移遞減，差異有顯

10、著性(P＜0.05)。 4 GAP-43及mRNA定性和半定量檢測(cè)免疫組化及RT-PCR結(jié)果顯示傷后1天三組均無表達(dá)；4、7天損傷組和治療組GAP-43及GAP-43mRNA均表達(dá)陽性，但差異不明顯；14天、28天，治療組GAP-43及GAP-43mRNA表達(dá)呈強(qiáng)陽性，損傷組表達(dá)呈弱陽性，治療組GAP-43及GAP-43mRNA表達(dá)強(qiáng)于損傷組，半定量分析差異有顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論：1 GAP-43是反映ON再生的可靠指

11、標(biāo)。 2.RhEPO玻璃體腔內(nèi)注射可以促進(jìn)視神經(jīng)損傷后RGCs的存活，對(duì)RGCs起到保護(hù)作用。 3.ON不全損傷后玻璃體內(nèi)注射rhEPO，可以促進(jìn)ON軸突的修復(fù)、再生。 4 ON不全損傷后玻璃體內(nèi)注射rhEPO，可以促進(jìn)視神經(jīng)GAP-43mRNA、GAP-43蛋白的表達(dá)，可能在視神經(jīng)損傷后ON的再生、修復(fù)的機(jī)制中起重要作用。關(guān)鍵訶：視神經(jīng)損傷；促紅細(xì)胞生成素；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；軸突；再生；生長相關(guān)蛋白-43；生長