重組人促紅細胞生成素對抗視網(wǎng)膜缺血性損傷的實驗研究.pdf

1、視網(wǎng)膜從發(fā)生學(xué)上來說屬于神經(jīng)系統(tǒng)向前延伸的部分，和腦組織均有相同的組織特點，即富含不飽和脂肪酸，線粒體中有大量的氧化代謝途徑，有豐富的血液供應(yīng)，對于缺血性損傷非常敏感。視網(wǎng)膜缺血是臨床上常見的一種綜合征，如青光眼、視網(wǎng)膜血管阻塞、糖尿病性視網(wǎng)膜病變，是導(dǎo)致視功能損害的常見原因。許多研究都發(fā)現(xiàn)視功能的損害是由缺血后再灌注損傷引起的，由于缺血再灌注損傷的機制還不是很清楚，治療的藥物也還很欠缺目前認為損傷的機制包括能量缺乏、鈣離子超載、自由基

2、的大量產(chǎn)生、興奮毒性氨基酸的過量釋放、各種神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏及由此而啟動了調(diào)控細胞凋亡的基因，使視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞因凋亡致死，從而引起視功能的損害。在眾多機制中，啟動調(diào)控細胞凋亡基因是一個關(guān)鍵性樞紐環(huán)節(jié)。 促紅細胞生成素(EPO)一種含唾液酸的酸性熱穩(wěn)定(80℃)糖蛋白，由165個氨基酸組成，相對分子量為34000D(道爾頓)，來源于腎臟及胎肝，在缺氧情況下，EPO可在腎外更多的器官中表達<'[6]>。1983年，Lin成功分離并克

3、隆了人EPO，它位于7號染色體長臂22區(qū)。1985年利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)出重組人促紅細胞生成素(rhEPO)，并廣泛應(yīng)用于臨床。 近年來許多研究表明，EPO具有神經(jīng)營養(yǎng)活性，Bocker-Meffert<'[7]>等在生后小鼠視網(wǎng)膜組織培養(yǎng)時分別加入EPO，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)，它們呈劑量依賴方式促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突的生長，當將EPOR的抗體加入培養(yǎng)基后其促軸突生長的作用被抑制。缺乏EPO-R的鼠10.5d時腦發(fā)

4、育受到影響，神經(jīng)祖細胞減少，凋亡增加，鼠腦細胞發(fā)生明顯凋亡<'[8]>’，同時Siren<'[9]>等的研究也顯示，經(jīng)腹腔注射rhEPO可使腦梗死面積縮小75％<'[9]>。對于視網(wǎng)膜而言，EPO能否同樣起到對抗視網(wǎng)膜缺血性損傷作用，觀察其對視網(wǎng)膜缺血時神經(jīng)元的凋亡和caspase-3蛋白表達的影響，以及對視網(wǎng)膜功能的影響，探討EPO的保護作用及其保護機制，正是本次實驗所要研究的課題． 目的 本實驗是通過建立兔急性視網(wǎng)膜

5、缺血模型，監(jiān)測閃光視網(wǎng)膜電圖(FERG)b波波幅的變化，用TUNE法計數(shù)視網(wǎng)膜切片中凋亡細胞的數(shù)量；比較石蠟切片視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，對實驗各組進行caspase-3蛋白免疫組化染色，觀察各組間的差異，研究EPO在視網(wǎng)膜缺血性損傷中的保護作用以及探索其保護作用的機制。 方法： 1．動物模型制備 參考<'[10]>和Naomichi Katai<'[11]>造模方法，用眼內(nèi)穿刺灌注壓力為110mmHg(14.6kp

6、a)使眼內(nèi)壓升高，維持2h，造成視網(wǎng)膜急性缺血動物模型， EPO組和生理鹽水組分別在缺血后5分鐘給注射rhEPO(1000U/kg)和等量生理鹽水腹腔注射<'[10]>。 2．ERG b波的監(jiān)測 健康的新西蘭大白兔12只，隨機分為2組，分別為生理鹽水組、EPO治療組，12只兔在造模前30 min和造模后第12h、24h、72h分別進行視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)檢查。 3．視網(wǎng)膜組織病

7、理切片 健康的新西蘭大白兔28只，隨機分為正常組，生理鹽水組和EPO治療組，每組4只兔子，(后兩組又分為造模后12h、24h、72h三組)，共7組，各組按各時間點摘取眼球，常規(guī)制成石蠟切片進行HE染色，于不同時間點在光鏡下觀察EPO組與生理鹽水組視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。 4．TUNEL法檢測視網(wǎng)膜凋亡細胞 將各組按時間點摘取眼球固定后，沿眼球矢狀面作連續(xù)石蠟切片，片厚5μm，用TUENL方法做細胞凋亡檢測，了解視網(wǎng)

8、膜細胞的凋亡情況，并在高倍鏡下進行TUNEL陽性細胞計數(shù)后進行統(tǒng)計學(xué)分析。 5．caspase-3免疫組化檢測 將各組按時間點摘取眼球固定后，沿眼球矢狀面作連續(xù)石蠟切片，片厚5um，用免疫組化SABC法，觀察視網(wǎng)膜內(nèi)caspase-3蛋白的表達，在高倍鏡下對陽性細胞進行計數(shù)后進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果： 1．ERG觀察結(jié)果 ERGb波振幅在視網(wǎng)膜缺血損傷后檢測第12h時的波幅比較低，與缺血前基線值比較

9、有顯著性差異(P<0.01)。以后隨著時間的延長其振幅值逐漸升高，但實驗結(jié)束時兩組振幅值均沒有達到基線水平，但EPO治療組ERG-b波振幅值在各個時間點顯著高于生理鹽水組(P<0.05)。 2．凋亡細胞計數(shù)的結(jié)果顯示 正常兔視網(wǎng)膜TUNEL染色陰性，治療組和生理鹽水組都有凋亡細胞的出現(xiàn)，且趨勢都是從12h到72h逐漸減少，且治療組比生理鹽水組明顯減少。兩組凋亡細胞計數(shù)有顯著性差異(P<0.05)。 3．視網(wǎng)膜組織

10、病理切片觀察結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示治療組和正常對照組形態(tài)、結(jié)構(gòu)、厚度均相似，無明顯的變化。而生理鹽水組則發(fā)生了明顯的結(jié)構(gòu)層次紊亂，厚度也發(fā)生改變，尤其以內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細胞層的變化更為明顯。 4．caspalse-3免疫組化檢測 caspase-3免疫組化檢測結(jié)果顯示正常大鼠視網(wǎng)膜caspase-3染色陰性，而兩組再灌注后各個時間段GCL層和ONL可觀察到陽性染色，兩組24h組陽性染色的細胞最多，同一時間點的陽性細