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文檔簡介
1、蛋白激酶CK2是一種真核細胞中普遍存在的信使非依賴性絲/蘇氨酸蛋白激酶。CK2是由兩個催化亞基(α和α’)和兩個調(diào)節(jié)亞基(β)組成的異四聚體(α2β2.αα'β2或α’2β2)。它參與廣泛的細胞正常功能的調(diào)控,如基因表達,蛋白合成,細胞周期,細胞生長及分化,同時還參與如癌癥發(fā)生,抗凋亡等病理過程。2003年已報道CK2有多達307種作用底物,其中243種得到體內(nèi)實驗確證,許多新的CK2底物還在不斷地被發(fā)現(xiàn)。CK2在睪丸及腦組織中活性最高
2、,睪丸組織中CK2α'亞基水平是腦組織的兩倍;CK2β亞基比腦組織高3~4倍,比其它組織高將近8~10倍。因此本研究擬從人睪丸cDNA文庫中,利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與蛋白激酶CK2α'亞基相互作用的蛋白。 方法:構(gòu)建于pACT2質(zhì)粒(酵母雙雜交中的AD質(zhì)粒)的人睪丸cDNA文庫和本室已成功構(gòu)建的BD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染感受態(tài)酵母菌AH109后得到的初篩候選陽性克隆,從這些候選克隆中,通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109獲得單一文庫質(zhì)粒,再進行自主
3、激活報告基因檢測和一對一回復(fù)性雜交實驗,最后篩選出真陽性克隆(即與人蛋白激酶CK2α'相互作用的蛋白)。經(jīng)上述一對一回復(fù)確證為陽性相互作用的AD質(zhì)粒。以pACT2質(zhì)粒的通用引物為測序引物測定該質(zhì)粒的插入片段cDNA序列。通過國際互聯(lián)網(wǎng)絡(luò),以美國國立生物信息中心(NCBI)的BLAST作為主要的檢索工具,檢索主要程序采用BLAST,對相互作用蛋白的cDNA序列進行同源性分析,最終確定該相互作用蛋白的名稱。通過原核表達獲得陽性克隆蛋白,用以
4、進一步證實CK2α'與陽性克隆蛋白間的相互作用。 結(jié)果:(1)經(jīng)過酵母雙雜交實驗,篩選出10種與蛋白激酶CK2α'相互作用蛋白,核酸序列分析及同源性檢索結(jié)果為:①人CK2β亞基;②人COP9組成性光形成性同源亞基5;③人基質(zhì)蛋白3;④人核酸酶敏感元件結(jié)合蛋白1;⑤人核轉(zhuǎn)換蛋白1;⑥人9KD1癌癥/睪丸相關(guān)蛋白;⑦人線粒體細胞色素氧化酶Ⅲ;⑧人依莫帕米結(jié)合蛋白(異構(gòu)酶)以及兩個未知功能蛋白。(2)人9kD癌癥/睪丸相關(guān)蛋白的原核
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