Notch信號在小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)元死亡中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是指由諸如剪切、撕扯、牽拉等性質(zhì)的機械力對腦組織所造成的物理性損傷，可導(dǎo)致挫傷、出血和水腫等即刻的臨床效應(yīng)。TBI是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，致殘、死率極高。研究發(fā)現(xiàn)，引起 TBI的主要機制包括谷氨酸興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等等，而這些病理機制作用的最終結(jié)果則導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡及其相關(guān)功能的喪失。嚴重腦損傷患者即使被挽救生命，但因為神經(jīng)

2、元的死亡是無法再生替代的，因此損傷引起患者的多種功能缺陷仍的后期恢復(fù)還缺乏有效的治療措施，給家庭與社會造成巨大的經(jīng)濟負擔和精神負擔。目前對 TBI后分子代謝及調(diào)控的機制還不十分清楚。因此，積極探索內(nèi)源性調(diào)控神經(jīng)元死亡和存活的關(guān)鍵分子成為TBI治療的重要策略。
　　Notch信號作為一類在物種進化過程中高度保守的信號通路，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。累積的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多種不同類型的腦損傷模型中均存在Notch信號

3、的激活。通過化學抑制劑或基因調(diào)控的方法抑制 Notch信號的活性及表達在缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。然而，一些研究也報道抑制Notch信號加重了缺血性腦損傷后的神經(jīng)細胞損傷。這些矛盾的結(jié)論使Notch在神經(jīng)元損傷中的作用充滿爭議。因此，探索并了解Notch信號在TBI后發(fā)揮何種作用及相關(guān)的作用機制對于TBI的救治來說具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　實驗?zāi)康模?br>　　（1）探索Notch在TBI后的時空變化規(guī)律及功能；（2）

4、探索Notch在TBI后神經(jīng)元凋亡和自噬中的作用及相關(guān)的機制；（3）探索TBI后自噬對凋亡的影響作用。實驗方法
　　（1）細胞培養(yǎng)：離體的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)；（2）造模：動物實驗采用液壓打擊致腦損傷模型，離體實驗使用機械性劃傷模型，分別模擬在體與離體條件下的創(chuàng)傷性腦損傷；（3）神經(jīng)元致傷效果：采用 LDH試劑盒檢測細胞損傷破壞的程度，采用CCK8試劑盒檢測神經(jīng)元損傷后的存活數(shù)量；（4）分子表達與空間定位：分別采用免疫熒光、Wester

5、n blot及免疫組化等方法檢測主要分子的表達規(guī)律及空間定位；（5）腦損傷程度：采用干濕重法檢測 TBI后小鼠腦水腫的程度；采用神經(jīng)功能學評分評估TBI后小鼠神經(jīng)功能受損的程度；（6）細胞凋亡：western blot、Caspase檢測試劑盒以及TUNEL染色檢測細胞凋亡；（7） Notch調(diào)控：利用 Notch信號抑制劑 GSI及下調(diào)Notch信號在神經(jīng)元的表達，采用Notch激動劑重組鼠jagged1蛋白上調(diào)Notch信號的活性；

6、（8）ERK通路調(diào)控：使用特異性阻斷劑PD98059抑制ERK通路的活性；（9）自噬調(diào)控：利用自噬抑制劑3-MA和自噬激動劑雷帕霉素分別來下調(diào)和上調(diào)自噬，并通過檢測LC3的蛋白表達反應(yīng)自噬水平。
　　實驗結(jié)果：
　　實驗一：與對照組比較，離體神經(jīng)元機械性劃傷模型可在傷后1h顯著升高神經(jīng)元LDH的漏出并減少存活細胞數(shù)量；劃傷后6h在光鏡下可見視野內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，Hochest染色顯示神經(jīng)元中的凋亡細胞數(shù)明顯增加，透射電鏡

7、下可看到雙層膜的自噬體，免疫熒光結(jié)果顯示 NICD主要定位于胞漿和胞核。在小鼠液壓打擊腦損傷模型中：與對照組比較 TBI后出現(xiàn)明顯腦水腫及神經(jīng)功能障礙；TBI24h后TUNEL染色顯示損傷側(cè)皮層中TUNEL染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，DAB染色顯示 NICD陽性細胞較對照組顯著增加，主要定位在損傷側(cè)皮層部位神經(jīng)元的胞核中。
　　此外，離體和在體的western blot檢測均顯示：TBI后神經(jīng)元中NICD、活化caspase3與

8、LC3Ⅱ的表達均早期開始上調(diào)，達到峰值后逐漸回落。
　　實驗二：分別在離體和在體模型上給予Notch信號抑制劑GSI預(yù)處理，兩種模型上NICD的表達均受到明顯抑制。GSI顯著降低離體神經(jīng)元機械性劃傷6h后LDH漏出并增加了細胞存活。Western blot檢測顯示GSI明顯降低了細胞劃傷后的caspase3和LC3的激活。在體模型中與TBI組相比，GSI明顯降低了TBI后小鼠腦含水量并改善了其功能學評分，western blot檢

9、測同樣顯示 GSI預(yù)處理明顯降低了活化caspase3和LC3Ⅱ的蛋白表達量，TUNEL檢測顯示給予GSI處理降低了TUNEL陽性細胞量。
　　實驗三：離體培養(yǎng)的神經(jīng)元機械性劃傷后磷酸化ERK的表達從傷后1h出現(xiàn)高表達，隨后逐漸回落至24h恢復(fù)正常水平。使用ERK抑制劑PD98059預(yù)處理可明顯降低磷酸化ERK水平，同時活化caspase3和LC3Ⅱ的表達也受到明顯抑制。PD98059顯著降低離體神經(jīng)元機械性劃傷后 LDH漏出并增

10、加了細胞存活率。使用 GSI抑制Notch信號后，發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK明顯下降。同時給予Notch激動劑jagged1和PD98059后發(fā)現(xiàn)jagged1可明顯上調(diào)損傷后NICD、磷酸化ERK、活化caspase3和LC3Ⅱ的蛋白表達，而jagged1的這些作用可被PD98059明顯抑制.
　　實驗四：離體培養(yǎng)的神經(jīng)元機械性劃傷前1h給予自噬抑制劑3-MA和激動劑雷帕霉素預(yù)處理。損傷后6h發(fā)現(xiàn)3-MA可明顯降低LC3Ⅱ表達和神經(jīng)元存活

11、率并增加細胞LDH漏出，TUNEL染色顯示3-MA明顯增加了TUNEL陽性細胞數(shù)量，同時雷帕霉素則發(fā)揮了完全相反的作用。最后使用caspase活性試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)激活自噬可能通過調(diào)控線粒體caspase9活性來影響凋亡。
　　實驗結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果證實，TBI后阻斷Notch信號可產(chǎn)生神經(jīng)保護效應(yīng)；Notch信號可能與ERK相互作用共同調(diào)節(jié)了TBI后神經(jīng)元的凋亡和自噬；自噬在TBI后發(fā)揮神經(jīng)保護作用且調(diào)控自噬可影響TB