Notch信號在小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經元死亡中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是指由諸如剪切、撕扯、牽拉等性質的機械力對腦組織所造成的物理性損傷，可導致挫傷、出血和水腫等即刻的臨床效應。TBI是一種常見的中樞神經系統(tǒng)損傷性疾病，致殘、死率極高。研究發(fā)現(xiàn)，引起 TBI的主要機制包括谷氨酸興奮性毒性、氧化應激、炎癥反應等等，而這些病理機制作用的最終結果則導致神經元的死亡及其相關功能的喪失。嚴重腦損傷患者即使被挽救生命，但因為神經

2、元的死亡是無法再生替代的，因此損傷引起患者的多種功能缺陷仍的后期恢復還缺乏有效的治療措施，給家庭與社會造成巨大的經濟負擔和精神負擔。目前對 TBI后分子代謝及調控的機制還不十分清楚。因此，積極探索內源性調控神經元死亡和存活的關鍵分子成為TBI治療的重要策略。
　　Notch信號作為一類在物種進化過程中高度保守的信號通路，在神經系統(tǒng)的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。累積的研究結果發(fā)現(xiàn)在多種不同類型的腦損傷模型中均存在Notch信號

3、的激活。通過化學抑制劑或基因調控的方法抑制 Notch信號的活性及表達在缺血性腦損傷中發(fā)揮神經保護作用。然而，一些研究也報道抑制Notch信號加重了缺血性腦損傷后的神經細胞損傷。這些矛盾的結論使Notch在神經元損傷中的作用充滿爭議。因此，探索并了解Notch信號在TBI后發(fā)揮何種作用及相關的作用機制對于TBI的救治來說具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　實驗目的：
　?。?）探索Notch在TBI后的時空變化規(guī)律及功能；（2）

4、探索Notch在TBI后神經元凋亡和自噬中的作用及相關的機制；（3）探索TBI后自噬對凋亡的影響作用。實驗方法
　　（1）細胞培養(yǎng)：離體的皮層神經元培養(yǎng)；（2）造模：動物實驗采用液壓打擊致腦損傷模型，離體實驗使用機械性劃傷模型，分別模擬在體與離體條件下的創(chuàng)傷性腦損傷；（3）神經元致傷效果：采用 LDH試劑盒檢測細胞損傷破壞的程度，采用CCK8試劑盒檢測神經元損傷后的存活數(shù)量；（4）分子表達與空間定位：分別采用免疫熒光、Wester

5、n blot及免疫組化等方法檢測主要分子的表達規(guī)律及空間定位；（5）腦損傷程度：采用干濕重法檢測 TBI后小鼠腦水腫的程度；采用神經功能學評分評估TBI后小鼠神經功能受損的程度；（6）細胞凋亡：western blot、Caspase檢測試劑盒以及TUNEL染色檢測細胞凋亡；（7） Notch調控：利用 Notch信號抑制劑 GSI及下調Notch信號在神經元的表達，采用Notch激動劑重組鼠jagged1蛋白上調Notch信號的活性；

6、（8）ERK通路調控：使用特異性阻斷劑PD98059抑制ERK通路的活性；（9）自噬調控：利用自噬抑制劑3-MA和自噬激動劑雷帕霉素分別來下調和上調自噬，并通過檢測LC3的蛋白表達反應自噬水平。
　　實驗結果：
　　實驗一：與對照組比較，離體神經元機械性劃傷模型可在傷后1h顯著升高神經元LDH的漏出并減少存活細胞數(shù)量；劃傷后6h在光鏡下可見視野內神經元數(shù)量明顯減少，Hochest染色顯示神經元中的凋亡細胞數(shù)明顯增加，透射電鏡

7、下可看到雙層膜的自噬體，免疫熒光結果顯示 NICD主要定位于胞漿和胞核。在小鼠液壓打擊腦損傷模型中：與對照組比較 TBI后出現(xiàn)明顯腦水腫及神經功能障礙；TBI24h后TUNEL染色顯示損傷側皮層中TUNEL染色陽性的神經元數(shù)量明顯增加，DAB染色顯示 NICD陽性細胞較對照組顯著增加，主要定位在損傷側皮層部位神經元的胞核中。
　　此外，離體和在體的western blot檢測均顯示：TBI后神經元中NICD、活化caspase3與

8、LC3Ⅱ的表達均早期開始上調，達到峰值后逐漸回落。
　　實驗二：分別在離體和在體模型上給予Notch信號抑制劑GSI預處理，兩種模型上NICD的表達均受到明顯抑制。GSI顯著降低離體神經元機械性劃傷6h后LDH漏出并增加了細胞存活。Western blot檢測顯示GSI明顯降低了細胞劃傷后的caspase3和LC3的激活。在體模型中與TBI組相比，GSI明顯降低了TBI后小鼠腦含水量并改善了其功能學評分，western blot檢

9、測同樣顯示 GSI預處理明顯降低了活化caspase3和LC3Ⅱ的蛋白表達量，TUNEL檢測顯示給予GSI處理降低了TUNEL陽性細胞量。
　　實驗三：離體培養(yǎng)的神經元機械性劃傷后磷酸化ERK的表達從傷后1h出現(xiàn)高表達，隨后逐漸回落至24h恢復正常水平。使用ERK抑制劑PD98059預處理可明顯降低磷酸化ERK水平，同時活化caspase3和LC3Ⅱ的表達也受到明顯抑制。PD98059顯著降低離體神經元機械性劃傷后 LDH漏出并增

10、加了細胞存活率。使用 GSI抑制Notch信號后，發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK明顯下降。同時給予Notch激動劑jagged1和PD98059后發(fā)現(xiàn)jagged1可明顯上調損傷后NICD、磷酸化ERK、活化caspase3和LC3Ⅱ的蛋白表達，而jagged1的這些作用可被PD98059明顯抑制.
　　實驗四：離體培養(yǎng)的神經元機械性劃傷前1h給予自噬抑制劑3-MA和激動劑雷帕霉素預處理。損傷后6h發(fā)現(xiàn)3-MA可明顯降低LC3Ⅱ表達和神經元存活

11、率并增加細胞LDH漏出，TUNEL染色顯示3-MA明顯增加了TUNEL陽性細胞數(shù)量，同時雷帕霉素則發(fā)揮了完全相反的作用。最后使用caspase活性試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)激活自噬可能通過調控線粒體caspase9活性來影響凋亡。
　　實驗結論：
　　我們的研究結果證實，TBI后阻斷Notch信號可產生神經保護效應；Notch信號可能與ERK相互作用共同調節(jié)了TBI后神經元的凋亡和自噬；自噬在TBI后發(fā)揮神經保護作用且調控自噬可影響TB