組蛋白去乙酰化酶抑制劑對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的神經(jīng)保護作用及機制研究.pdf

1、第一部分組蛋白去乙?；敢种苿㏒criptaid對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的神經(jīng)保護作用
　　創(chuàng)傷性腦損傷(traumaitc brain injury，TBI)是神經(jīng)外科領(lǐng)域常見的急癥之一，目前已成為全世界35歲以下青壯年人群第一位死亡和致殘原因。但是目前臨床上尚無一種確切的藥物對腦損傷肯定有效。最新研究發(fā)現(xiàn)，在TBI后組蛋白乙?；斤@著降低，并且可能與繼發(fā)性損傷如氧化應(yīng)激和興奮性毒性相關(guān)。使用某些組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑能

2、明顯改善TBI后運動功能，增強神經(jīng)可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力，減輕腦組織損傷，這提示HDAC抑制劑對于TBI可能是一種非常有潛力多效神經(jīng)保護劑。Scriptaid是異羥肟酸類中較新型的HDAC抑制劑，副作用較小，安全系數(shù)較高，目前國內(nèi)外還沒有將Scriptaid運用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的報道。因此，十分有必要將Scriptaid對于TBI損傷后的神經(jīng)保護作用作全面評估，同時對于其可能涉及細部、分子機制作深入研究。
　　我們首先建立標準化的

3、小鼠控制性皮層撞擊模型(controlled cortical impact，CCI)實現(xiàn)可重復(fù)性的創(chuàng)傷性腦損傷，來模擬人類腦外傷情況。手術(shù)后0.5或12小時分別給予1.5、3.5、5.5 mg/Kg Scriptaid腹腔注射。采用肌力測試、前肢不對稱測試以及錯步實驗來評測小鼠短期和長期運動功能。TBI后29至34天利用水迷宮測試認知功能。焦油紫染色用來分析計算腦損傷體積和計算海馬CA3區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量。微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)

4、組織化學(xué)染色結(jié)合Fluo-Jade B染色來分析創(chuàng)傷后神經(jīng)元退行性變。同時為了探討Scriptaid神經(jīng)保護機制，我們利用免疫組化和Western bolt方法來研究相關(guān)信號通路激活情況。
　　研究結(jié)果顯示，Scriptaid對于創(chuàng)傷性腦損傷小鼠具有明顯的神經(jīng)保護作用，且存在著劑量依賴關(guān)系（尤以3.5μg/g劑量療效最佳），即使TBI后12小時給予治療仍然有效;TBI后損傷周邊區(qū)HDAC1、HDAC2、HDAC3具有不同程度增加，

5、使用Scriptaid后能明顯抑制HDAC活性，增強乙?；疕3、H4水平。Scriptaid治療對于TBI后小鼠具有長期的神經(jīng)保護作用，能明顯改善神經(jīng)功能評分，提高學(xué)習(xí)、記憶能力，減少海馬CA3區(qū)神經(jīng)元丟失，阻止神經(jīng)元退行性變。免疫熒光和Western blot結(jié)果顯示p-AKT和p-PTEN于TBI后在損傷側(cè)皮層和海馬CA3區(qū)顯著下降，而總AKT和PTEN水平并沒有發(fā)生變化。使用Scriptaid治療后能使p-PTNE水平增加，進而增

6、強PTEN的穩(wěn)定性而使其活性下降，從而減少對于AKT通路的負性調(diào)控作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，S嘶ptaid能通過增加PTEN磷酸化激酶ROCK1 mRNA表達來調(diào)控PTEN的磷酸化。最后，使用AKT通路的抑制劑LY294002后，能逆轉(zhuǎn)Scriptaid的神經(jīng)保護作用，進一步反向證明Scriptaid通過激活PTEN/AKT通路來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑Scriptaid能顯著減輕TBI造成的急、慢性損害

7、，改善神經(jīng)功能，減少TBI后腦組織缺失，同時能明顯減輕海馬神經(jīng)元變性壞死，增強學(xué)習(xí)記憶功能，其作用與激活PTEN/PI3K/AKT通路有關(guān)。本實驗為臨床運用Scriptadi治療TBI，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，提供了重要的實驗依據(jù)。
　　第二部分抑制組蛋白去乙酰化酶可調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化動態(tài)并參與TBI白質(zhì)損傷修復(fù)
　　創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）不僅導(dǎo)致腦灰質(zhì)損傷，同時可產(chǎn)生嚴重的白質(zhì)損傷

8、。研究發(fā)現(xiàn)在TBI病人白質(zhì)損傷的程度與長期的運動和認知功能缺陷有相關(guān)性。因此，為何在臨床前實驗中，神經(jīng)保護劑如果只是單一強調(diào)對灰質(zhì)的保護，一旦過度到臨床試驗時通常都會失敗。本研究發(fā)現(xiàn)新型HDAC抑制劑Scriptaid能增強組蛋白乙酰化，并對TBI具有強烈的神經(jīng)保護作用，但是其對于TBI白質(zhì)損傷的演變和預(yù)后依然未知，很值得再深入研究。
　　首先通過標準化的控制性皮層撞擊來建立可重復(fù)性的小鼠腦外傷模型。運用RT-PCR的方法測定腦組

9、織內(nèi)M1期和M2期不同的標記物分子mRNA水平時間依從性的表達情況;采用免疫熒光染色、共聚焦成像等方法觀察TBI后皮層、紋狀體、胼胝體等不同腦區(qū)小膠質(zhì)細胞激活的時間依從性。髓鞘相關(guān)蛋白(MBP)和非磷酸化神經(jīng)絲重鏈(SMI-32)免疫熒光雙標技術(shù)來檢測TBI白質(zhì)損傷情況，并與小膠質(zhì)細胞極化動態(tài)做相關(guān)性分析。使用HDAC抑制劑Scirptaid于TBI后6小時給予3.5 mg/Kg腹腔注射，小鼠于不同時間點處死，最長觀察直至術(shù)后35天。體

10、外實驗中，酶聯(lián)免疫吸附實驗來檢測小膠質(zhì)細胞炎性因子釋放。采用條件性培養(yǎng)基交換系統(tǒng)來分析HDAC抑制對于小膠質(zhì)細胞的極化作用以及不同亞型小膠質(zhì)細胞對于損傷后少突膠質(zhì)細胞的影響。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBI后小膠質(zhì)細胞會時間依從性的極化現(xiàn)象，即經(jīng)歷了短暫性M2型之后轉(zhuǎn)化為更持久的M1型。同時TBI后存在時間依從性白質(zhì)損傷，伴有M1小膠質(zhì)細胞增加，M2型減少，而且前者與白質(zhì)損傷程度呈現(xiàn)正相關(guān);體外實驗也表明，M1型小膠質(zhì)細胞能加劇少突膠質(zhì)細胞

11、死亡，而M2型則能發(fā)揮保護作用。Scriptaid后能明顯抑制小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)，并能調(diào)控小膠質(zhì)細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變。重要的是，Scriptaid通過介導(dǎo)對于小膠質(zhì)細胞亞型的調(diào)控作用來發(fā)揮對于TBI白質(zhì)損傷的保護作用，具有維持白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)形態(tài)，保持髓鞘的完整性的功能。
　　綜述所述，機械性腦外傷可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的急、慢性的炎癥反應(yīng)。小膠質(zhì)細胞由短暫的M2亞型很快被慢性的M1亞型所取代，且后者與白質(zhì)損傷的嚴重程度