離體神經(jīng)元損傷后Homer1a與Notch信號的作用及關(guān)系研究.pdf

1、Notch基因于1917年在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，因為其部分功能缺失后可致果蠅翅膀邊緣出現(xiàn)切跡而得名。Notch信號通路是一條細胞間的保守的信號傳導途徑，在中樞和外周組織許多器官早期的發(fā)育過程中起著非常重要的作用。該信號途徑的精確調(diào)控對于大多數(shù)組織的正常發(fā)育至關(guān)重要。既往文獻顯示,腦組織冷凍損傷后Notch信號通路的表達出現(xiàn)短暫性升高。有學者推測，Notch信號通路可能在腦損傷后發(fā)揮重要作用。Homer蛋白家族于1997年被首次發(fā)現(xiàn)。Home

2、r蛋白參與mGluR1a從胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到突觸后膜的轉(zhuǎn)運及在突觸后膜的定位，并可影響細胞Ca2+通道、Shank、細胞骨架蛋白等的作用，是細胞信號傳導系統(tǒng)的關(guān)鍵點。既往文獻顯示Homer蛋白在細胞水腫、壞死、凋亡、再生的各種信號途徑中發(fā)揮重要作用。本實驗通過體外原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞及其機械性損傷模型上采用免疫組化和蛋白印跡的方法，研究了Notch信號通路和Homer-1a蛋白在培養(yǎng)神經(jīng)元細胞中的表達與互相作用的規(guī)律，并初步探討其意義，為下一

3、步探尋創(chuàng)傷性腦損傷中可能的分子機制打下基礎(chǔ)。
　　實驗一體外培養(yǎng)小鼠腦皮層神經(jīng)元機械性損傷模型的建立
　　目的建立并驗證原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元機械性損傷模型，為下一步進行神經(jīng)元損傷的分子病理學實驗奠定基礎(chǔ)。方法胎鼠大腦皮層神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)，光鏡下觀察其生長情況，培養(yǎng)7天待神經(jīng)元成熟后，用移液器槍頭劃傷神經(jīng)元造成機械性損傷。觀測細胞的形態(tài)改變，并檢測培養(yǎng)液乳酸脫氫酶活性來評價神經(jīng)元損傷情況，驗證模型是否可行。結(jié)果神經(jīng)元體外培養(yǎng)7

4、天后，光鏡下可見神經(jīng)元細胞核清晰，呈圓形，核仁較清晰。胞體呈多形性，胞質(zhì)透亮，有較多軸、樹突自胞體伸出，且在神經(jīng)元之間交織成網(wǎng)。機械性劃傷后傷后即見劃傷區(qū)域神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完全消失，呈空白區(qū)，可見較多細胞碎屑，損傷區(qū)周圍細胞突起受損，培養(yǎng)液乳酸脫氫酶活性升高。結(jié)論利用胎鼠大腦皮層體外原代培養(yǎng)生成的神經(jīng)元所制的神經(jīng)元劃傷模型是一種簡易有效的體外培養(yǎng)神經(jīng)元機械性損傷模型。
　　實驗二NICD和Homer-1a在神經(jīng)元機械性損傷模型中分布和表

5、達趨勢
　　目的觀察NICD與Homer-1a在正常體外培養(yǎng)神經(jīng)元上的分布與損傷后的表達趨勢。方法利用免疫組織化學法檢驗成熟神經(jīng)元上NICD與Homer-1a的分布，通過WesternBlot方法檢測神經(jīng)元機械性損傷后NICD和Homer-1a的表達趨勢。結(jié)果體外培養(yǎng)成熟神經(jīng)元的胞體和突起上具有NICD和Homer-1a的共表達，機械性損傷后，NICD和Homer-1a在不同時間點（1h,3h,6h,12h,24h）的表達分別呈現(xiàn)

6、一定趨勢。結(jié)論NICD和Homer-1a共表達于成熟神經(jīng)元，并可能在神經(jīng)元機械性損傷中發(fā)揮著一定作用。
　　實驗三改變Notch信號對神經(jīng)元機械損傷的作用和對Homer-1a的影響目的觀察改變Notch信號對神經(jīng)元機械損傷后的作用和對Homer-1a的影響。方法DAPT和VPA分別預處理神經(jīng)元24h，神經(jīng)元機械性損傷后，通過WesternBlot方法檢測Caspase-3和Homer-1a的變化。結(jié)果機械性損傷后，與損傷體組比較，

7、DAPT處理組Caspase-3明顯降低（P＜0.05），Homer-1a表達降低（P＜0.05）；VPA處理組Caspase-3明顯升高（P＜0.05），Homer-1a表達升高（P＜0.05）。結(jié)論抑制Notch信號能減少機械性損傷后神經(jīng)元的凋亡，而上調(diào)Notch信號能增加機械性損傷后神經(jīng)元的凋亡，此作用可能與Notch信號對Homer-1a的調(diào)控有關(guān)。
　　實驗四過表達Homer-1a對神經(jīng)元機械損傷的作用和對Notch信號

8、的影響
　　目的觀察過表達Homer-1a對神經(jīng)元機械損傷后的作用和對Notch信號的影響。方法病毒載體預處理神經(jīng)元48h，過表達Homer-1a，神經(jīng)元機械性損傷后，通過WesternBlot方法檢測Caspase-3和NICD的變化。結(jié)果機械性損傷后24h，過表達Homer-1a組與對照組和空載體組比較，過表達Homer-1a組Caspase-3明顯升高（P＜0.05），對Notch信號并無明顯影響（P>0.05）。結(jié)論過表達