Homer1a在NMDA神經(jīng)元損傷中的作用及其與nNOS相關(guān)性研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是人類致傷致殘的主要原因之一,其可分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷,其中繼發(fā)性腦損傷是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。TBI早期谷氨酸大量釋放,作用于各類谷氨酸受體而發(fā)揮興奮性神經(jīng)毒作用,引起Ca2+通道持續(xù)開放致神經(jīng)元凋亡,是加重繼發(fā)性損傷的重要原因。谷氨酸與配體門控型 Ca2+通道 NMDA受體結(jié)合后激活該受體,允許 Ca2+大量通過,并且由于NMDAR失活緩慢,致使細(xì)胞內(nèi)

2、 Ca2+濃度升高上千倍,加重繼發(fā)性損害,因此研究如何降低NMDA受體引起的神經(jīng)元損傷,具有顯著的臨床意義。
　　Homer1a分子屬于 Homer蛋白家族,是一個作用廣泛的即早基因(Immediate Early Gene),和多種疾病的發(fā)生發(fā)展都有緊密聯(lián)系,能夠調(diào)控多種細(xì)胞分子功能。作為突觸后致密物質(zhì)(PSD)的一員,Homer1a可以調(diào)控突觸后致密物之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),是一個重要的鈣調(diào)節(jié)蛋白,它也可以通過物理替代相應(yīng)結(jié)構(gòu)起到負(fù)向

3、調(diào)節(jié)作用,并且 Homer1a能與 Shank、NMDA、nNOS等分子發(fā)生相互作用。目前 Homer1a與NMDAR所致?lián)p傷的關(guān)系以及和 NMDAR下游分子通路的關(guān)系尚不清楚,由于NMDA受體在繼發(fā)性腦損傷中的重要作用,研究Homer1a在NMDA受體所致神經(jīng)元損傷中的作用具有深遠(yuǎn)意義。
　　實(shí)驗(yàn)一NMDA動物模型的建立
　　目的：建立一種可靠而且穩(wěn)定的小鼠NMDA腦損傷模型,為進(jìn)一步研究損傷后腦組織病理生理變化及 NMD

4、A損傷機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法：將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和NMDA皮層注射損傷組,檢測NMDA腦損傷后NSS評分和血清NSE,觀察甲苯胺藍(lán)染色變化,闡明小鼠皮層注射 NMDA致腦損傷模型的效果。結(jié)果：小鼠皮層注射NMDA損傷后24h,光鏡下觀察不同組甲苯胺藍(lán)染色變化發(fā)現(xiàn):假損傷組皮層完整,尼氏體清晰可見,皮層無損傷,損傷組損傷灶周圍神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,染色變淺,皮層完整性受到破壞。皮層注射NMDA后觀察小鼠行為發(fā)現(xiàn):NMDA損傷組較假損傷組NS

5、S評分高,說明損傷嚴(yán)重。在損傷后12h,24h, NMDA損傷組小鼠血清中NSE高于假損傷組。結(jié)論：通過檢測腦損傷后NSS評分、血清NSE和甲苯胺藍(lán)染色的變化證實(shí),皮層注射NMDA致腦損傷模型具有明顯的損傷作用,是一種簡單而有效的在體NMDA腦損傷模型。
　　實(shí)驗(yàn)二體外培養(yǎng)小鼠腦皮層神經(jīng)元NMDA損傷模型的建立
　　目的建立一種可靠、穩(wěn)定而且有效的離體培養(yǎng)小鼠腦皮層神經(jīng)元 NMDA損傷模型。方法對培養(yǎng)成活一周的原代小鼠腦皮層

6、神經(jīng)元進(jìn)行神經(jīng)元純度鑒定。神經(jīng)元培養(yǎng)成活后11-15 d,按照Koh等的方法,進(jìn)行離體培養(yǎng)神經(jīng)元NMDA損傷。將神經(jīng)元隨機(jī)分為假損傷對照組和 NMDA損傷組,通過 Hoechst染色,檢測細(xì)胞內(nèi) ROS的水平以及細(xì)胞LDH釋放,明確神經(jīng)元NMDA損傷的效果。結(jié)果對培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行NF200染色顯示:培養(yǎng)的神經(jīng)元純化率較高。神經(jīng)元在NMDA損傷后0h,各組間的LDH濃度無明顯變化;傷后6h~24 h,與就假損傷對照組相比,損傷組的LDH濃

7、度高。進(jìn)行NMDA損傷后24 h,與對照組相比,細(xì)胞的凋亡顯著增加,ROS熒光亮度顯著升高。結(jié)論我們通過檢測培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)水平、ROS染色、以及Hoechst染色的變化證明,NMDA對神經(jīng)元有確切的致傷作用。該模型是一種簡單而且有效的離體皮層神經(jīng)元NMDA損傷模型,為研究NMDA所致神經(jīng)元死亡相關(guān)分子機(jī)制等提供了一個可靠、有效平臺。
　　實(shí)驗(yàn)三 NMDA損傷(在體與離體)后H

8、omer1a蛋白表達(dá)
　　目的通過在體及離體實(shí)驗(yàn),了解NMDA腦損傷后Homer1a表達(dá)變化。方法將小鼠或細(xì)胞分為假損傷對照組和NMDA損傷組,在NMDA腦損傷模型(在體與離體)基礎(chǔ)上,采用免疫組織化學(xué)法、免疫印跡法(Western Blotting)和PCR法檢測NMDA腦損傷后 Homer1a蛋白以及 mRNA的變化。結(jié)果在體模型中使用 NMDA注射皮層后24h,使用免疫組化染色法觀察周邊腦組織中 Homer1a蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)

9、NMDA注射組表達(dá)Homer1a蛋白的陽性神經(jīng)元數(shù)高于對照組。在離體NMDA腦損傷模型中,用免疫印跡法檢測 Homer1a蛋白在 NMDA損傷后的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)NMDA細(xì)胞損傷后6h至24h,Homer1a蛋白表達(dá)量明顯增加。用普通PCR方法檢測Homer1a mRNA,發(fā)現(xiàn)相比對照組,NMDA損傷組Homer1a mRNA于損傷后1h、3h表達(dá)明顯增加。結(jié)論 Homer1a蛋白和mRNA水平在NMDA損傷后增加,這提示Homer1a可

10、能在NMDA腦損傷中發(fā)揮著重要的作用,這種表達(dá)水平的增加可能與神經(jīng)元自身保護(hù)機(jī)制有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)四 NMDA損傷對Homer1a K/O小鼠的作用
　　目的通過在體實(shí)驗(yàn),明確NMDA損傷對Homer1a K/O小鼠的作用。方法首先對Homer1a基因敲除鼠進(jìn)行篩選與鑒定,后將小鼠分為2個組,KO(Knock Out)小鼠組和WT(Wild Type)小鼠組,建立小鼠NMDA腦損傷模型,用甲苯胺藍(lán)染色計(jì)算梗死面積、對小鼠進(jìn)行神

11、經(jīng)功能學(xué)評分(NSS),以及檢測血清NSE,明確Homer1a K/O小鼠和 WT小鼠的對 NMDA損傷作用效應(yīng)的區(qū)別。結(jié)果我們成功雜交出了Homer1a基因敲除鼠,普通PCR結(jié)果顯示,基因敲除小鼠有效,無Homer1a基因表達(dá),并且有Homer1c基因表達(dá)。小鼠皮層注射NMDA后24h,尼氏染色計(jì)算梗死面積后發(fā)現(xiàn)Homer1a K/O組較WT組腦皮層損傷重;NSS評分提示在12h、24h,Homer1a K/O組較WT組評分高;血清N

12、SE含量檢測提示損傷后24h,Homer1a K/O組血清中NSE較WT組高。結(jié)論這些結(jié)果提示,Homer1a基因敲除加重了NMDA引起的腦損傷,Homer1a基因?qū)MDA腦損傷具有保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)五體外模型中過表達(dá)Homer1a對NMDA神經(jīng)元損傷的影響
　　目的前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,敲除小鼠Homer1a基因加重NMDA腦損傷,推論Homer1a基因?qū)MDA腦損傷有保護(hù)作用,但仍需進(jìn)一步細(xì)胞模型中得到證實(shí)。方法進(jìn)行

13、腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)染 LV-Homer1a,鑒定表達(dá)后,將細(xì)胞分為對照損傷組,空載體組,Homer1a過表達(dá)組,建立NMDA損傷模型,觀察細(xì)胞細(xì)胞死亡率,進(jìn)行 Hoechst染色分析以及損傷后 LDH值測定,Western-Blot進(jìn)行損傷后p-Caspase-3分析。結(jié)果通過使用過表達(dá)Homer1a的慢病毒載體(LV-Homer1a)轉(zhuǎn)染神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Homer1a成功,能夠明顯檢測出外源性的Homer1a。用慢病毒載體(L

14、V-Homer1a)轉(zhuǎn)染神經(jīng)元,造模后24h,對各組神經(jīng)元進(jìn)行Hoechst染色,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染LV-Homer1a降低了凋亡細(xì)胞比例和,降低了p-Caspase3表達(dá)。LDH結(jié)果提示傷后6h、12h、24 h,與對照損傷組、LV-Vector損傷組比,LV-Homer1a的LDH濃度較低。結(jié)論這些結(jié)果提示,離體試驗(yàn)中,Homer1a能夠降低凋亡細(xì)胞的比例,保護(hù)神經(jīng)元,也驗(yàn)證了在體試驗(yàn)的結(jié)果。
　　實(shí)驗(yàn)六Homer1a對NMDAR致?lián)p傷

15、功能的影響以及nNOS的活性影響
　　目的前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),Homer1a對 NMDA所致?lián)p傷后的神經(jīng)元具有直接保護(hù)作用,但具體的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬在離體模型中研究損傷后Homer1a對NMDAR下游通路的影響,以及Homer1a對nNOS活性的影響。方法腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)成活后轉(zhuǎn)染LV-Homer1a,建立NMDA損傷模型,隨機(jī)將細(xì)胞分為NMDA損傷組、空載體組、轉(zhuǎn)染LV-Homer1a組,觀察細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS,Ca2

16、+、并進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄,用Western Blot檢測各組中細(xì)胞內(nèi)p-nNOS、p-ERK、p-CREB的表達(dá)。結(jié)果神經(jīng)元 NMDA損傷后24h,與對照組相比,轉(zhuǎn)染 LV-Homer1a降低了ROS生成和NMDA引起的鈣離子內(nèi)流。轉(zhuǎn)染 LV-Homer1a降低了神經(jīng)元NMDA受體的電流峰值。Western Blot結(jié)果提示:轉(zhuǎn)染 LV-Homer1a后降低NMDAR過度激活導(dǎo)致的ERK,CREB,nNOS的激活。結(jié)論這些結(jié)果提示,離

17、體神經(jīng)元轉(zhuǎn)染LV-Homer1a后,改變了NMDAR的屬性,降低了其通透性,減弱其下游通路的過度激活,這為進(jìn)一步闡明了Homer1a蛋白對NMDA腦損傷的保護(hù)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)七 Homer1a對神經(jīng)元中NMDAR以及NMDAR復(fù)合體的影響
　　目的前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),Homer1a對NMDA所致神經(jīng)元損傷具有直接保護(hù)作用,且改變了NMDA屬性以及其下游通路的活性,但是具體的機(jī)制尚不清楚。我們推測,Homer1a可能

18、是通過調(diào)控NMDAR本身分布以及NMDAR和相關(guān)的分子集團(tuán)結(jié)合發(fā)揮保護(hù)作用。方法通過向HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染NR1NR2B受體以及Homer1a,進(jìn)行膜片鉗記錄,按照轉(zhuǎn)染的分子不同分為空載體組、NR1/NR2B組、NR1/NR2B/Con組、NR1/NR2B/Homer1a組,研究Homer1a對NMDA受體功能的直接影響。在神經(jīng)元轉(zhuǎn)染LV-Homer1a后,將細(xì)胞分為空載體組、過表達(dá)Homer1a組,通過提取提純膜蛋白,檢測Homer

19、1a對NMDA受體亞基NR2B分布的影響,通過免疫共沉淀,檢測轉(zhuǎn)染 LV-Homer1a對NMDA受體亞基NR2B與nNOS蛋白結(jié)合的影響。結(jié)果在293T細(xì)胞上我們成功過表達(dá)了NR1NR2B,且具有受體活性,同時轉(zhuǎn)染LV-Homer1a發(fā)現(xiàn),Homer1a對293T細(xì)胞上的NR1/NR2B受體的峰值無明顯影響。體外培養(yǎng)神經(jīng)元轉(zhuǎn)染LV-Homer1a72h,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染LV-Homer1a后降低膜上 NR2B分布。通過對NR2B以及nNOS進(jìn)