姜黃素對(duì)氧化損傷海馬神經(jīng)元HO-1、nNOS表達(dá)的影響研究.pdf

1、研究背景：
　　血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血紅素分解代謝過(guò)程中的限速酶，人體內(nèi)的CO主要是由血紅素加氧酶(HO)代謝產(chǎn)生。HO有三種類型:誘導(dǎo)型(HO-1)、組成型(HO-2)及尚未明確的HO-3[1]。研究表明，HO-1不僅在機(jī)體生理狀態(tài)下發(fā)揮作用，更主要是在機(jī)體其他非正常狀態(tài)/應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)揮作用。HO-1參與活性氧、活性氮、缺血、細(xì)菌脂多糖、血紅素等誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究顯示HO-1表達(dá)升高可減輕應(yīng)

2、激損傷大鼠的腦組織形態(tài)與氧化應(yīng)激損傷程度，其機(jī)制可能與Nrf2-Keapl[(NF-E2-relatedfactor2，轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2)-(Kelch-likeECH—associated protein1，胞漿蛋白伴侶分子)]和PI3K/Akt/GSK-3β(phosphatidyllinositol-3-kinase/Akt/glycogen syntheses kinase-3β，磷脂酰肌醇激酶-3/絲蘇氨酸蛋白激酶

3、/糖原合成酶激酶-3β)通路有關(guān)[2-3]。血紅素在HO-1作用下分解為膽紅素、游離鐵離子和CO，這些物質(zhì)參與自由基的清除、炎癥因子的抑制釋放、轉(zhuǎn)錄激活因子的上調(diào)、tau蛋白的磷酸化和抑制HO-1的泛素化等病理生理過(guò)程[4-7]。HO-2主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及睪丸，它所產(chǎn)生的CO在神經(jīng)信號(hào)傳遞中起重要作用，與CO發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)的作用密切相關(guān);HO-2維持腦的正常生理功能，而HO-1與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。
　　一氧化氮合酶(nit

4、ric oxide syntheses，NOS)有三種同工酶，包括主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)型一氧化氮合酶(nitric oxide syntheses，nNOS)，存在于巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(nitric oxidesyntheses，eNOS)和主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(nitricoxide syntheses，iNOS)。在生物體內(nèi)，NOS利用L-精氨酸和分子氧作為底物，NADPH

5、輔酶作為輔助因子，經(jīng)過(guò)一系列氧化反應(yīng)生成一氧化氮(NO)和瓜氨酸。在神經(jīng)系統(tǒng)中NO作為一種重要的信號(hào)分子，參與了學(xué)習(xí)與記憶等重要的神經(jīng)生理活動(dòng)，同時(shí)對(duì)腦部血流具有調(diào)節(jié)作用，并參與神經(jīng)系統(tǒng)的免疫防御。另一方面過(guò)量的NO又生產(chǎn)細(xì)胞毒性氧化物質(zhì)（如氮自由基、過(guò)氧亞硝酸鹽等），與腦缺血損傷、癡呆、帕金森病等疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。因此，在正常生理?xiàng)l件下，神經(jīng)系統(tǒng)中存在著從時(shí)間與空間上精確調(diào)控NO產(chǎn)生、釋放、擴(kuò)散與滅活的機(jī)制，而這主要是通過(guò)調(diào)

6、控nNOS的活化與去活化實(shí)現(xiàn)的。研究證明nNOS通過(guò)與CB2(type2 cannabinoidreceptor，大麻素受體2)結(jié)合直接調(diào)節(jié)nNOS，進(jìn)而與抗氧化蛋白Hsp70和抗凋亡蛋白Bcl-2共同完成CB2通路，延遲神經(jīng)退行性變[8]。一氧化氮合酶調(diào)節(jié)體內(nèi)一氧化氮自由基和氧自由基平衡[9]，參與腦創(chuàng)傷后損傷及神經(jīng)再生、缺血再灌注損傷、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、腦卒中、精神分裂性疾病等病理生理過(guò)程[10-13]，其機(jī)制與脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)

7、羰基化、蛋白硝基化和自由基清除有關(guān)[14-15]。Rios R等[16]探討低濃度砷中毒性大鼠中樞損害模型發(fā)現(xiàn)，不僅活性氧與脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物可作為氧化應(yīng)激損傷的生物學(xué)標(biāo)志，nNOS也可作為氧化應(yīng)激損傷的生物學(xué)標(biāo)志之一。
　　姜黃素(curcumin，Cur)是姜科植物Curcuma longa根莖中分離得到的一種脂溶性多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化、抗纖維化、保護(hù)心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等功能[17-18]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Cur

8、對(duì)各種神經(jīng)退行性疾病和創(chuàng)傷性腦損傷有防治作用[19-20]，并證實(shí)Cur能保護(hù)多種細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷[21-22]。但關(guān)于Cur對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制的探討相對(duì)較少[23-24]。如前所述，HO-1與nNOS在一些病理狀態(tài)下與氧化應(yīng)激損傷存在著密切關(guān)聯(lián)，因此，本實(shí)驗(yàn)采用H2O2誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激的損傷模型，觀察Cur對(duì)HO-1、nNOS的影響，探討Cur抗氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為Cur的臨床應(yīng)用提供理

9、論依據(jù)。
　　目的:探討姜黃素對(duì)氧化應(yīng)激損傷海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制，為姜黃素的臨床應(yīng)用提供一些理論依據(jù)。方法:分離新生SD大鼠(≤24 h)的海馬，采用Neurobasal+2％B27無(wú)血清原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，倒置相差顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)情況、檢測(cè)神經(jīng)元純度，MTT法檢測(cè)神經(jīng)元活性，NeuN、NF-200進(jìn)行神經(jīng)元鑒定。培養(yǎng)至10 d，將細(xì)胞分為6組:空白對(duì)照組、損傷組、姜黃素處理組(2.5μmol/L、5.0μmol/L、

10、10.0μmol/L、20.0μmol/L)。等體積H2O2(1 mmol/L)處理海馬神經(jīng)元1h，建立氧化應(yīng)激損傷模型;用DMEM/F12輕洗2次，姜黃素各處理組分別加入濃度為2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L的姜黃素培養(yǎng)液300μl，空白對(duì)照組和損傷組分別加入無(wú)血清培養(yǎng)基300μl，培養(yǎng)孵育6h后利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞變化，MTT法測(cè)定各組神經(jīng)元活性，乳酸脫氫酶比色法和硫代巴比妥酸

11、法測(cè)定LDH活力和MDA濃度，免疫組化和免疫熒光測(cè)定海馬神經(jīng)元HO-1、nNOS的表達(dá)，RT-PCR測(cè)定HO-1、nNOS的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:1.海馬神經(jīng)元接種在培養(yǎng)板上3～4h細(xì)胞貼壁，第1d細(xì)胞長(zhǎng)出突起，第7～8d細(xì)胞突觸生長(zhǎng)迅速，第9～11d細(xì)胞交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛;20 d后細(xì)胞軸突縮短、斷裂、胞體無(wú)光暈。利用無(wú)血清培養(yǎng)基和差速貼壁方法培養(yǎng)的神經(jīng)元純度可達(dá)92％。MTT法檢測(cè)較其他各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)元活性，9～11

12、d的海馬神經(jīng)元活性較高，P＜0.05，利于海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型建立。2.倒置相差顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型(1h)，細(xì)胞突觸粘附力降低，部分細(xì)胞漂浮，軸突粗糙、斷裂，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)空泡。3.6h后倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，5.0μmol/L組、10.0μmol/L組細(xì)胞形態(tài)與1h時(shí)比較無(wú)明顯變化;2.5μmol/L組、20.0μmol/L組軸突縮短比1h時(shí)明顯，但軸突無(wú)斷裂、胞體仍有光暈;損傷組細(xì)胞軸突縮短、斷裂、胞體光

13、暈減低比1h時(shí)更明顯、數(shù)量更多;空白對(duì)照組細(xì)胞軸突完整、光滑、交織成網(wǎng)狀、胞體光暈強(qiáng)度與1h時(shí)無(wú)變化。4.MTT檢測(cè)5.0μmol/L組和10.0μmol/L組較損傷組神經(jīng)元活力明顯增高，P＜0.05;較損傷組，空白對(duì)照組神經(jīng)元活力更強(qiáng)，P＜0.05;5.0μmol/L組和10.0μmol/L組神經(jīng)元活力與2.5μmol/L組、20.0μmol/L組神經(jīng)元活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;2.5μmol/L組、20.0μmol/

14、L組較損傷組神經(jīng)元活力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。5.LDH活力檢測(cè)5μmol/L組和10μmol/L組與損傷組比較LDH活力降低，P＜0.05;損傷組與空白對(duì)照組比較LDH活力增強(qiáng)，P＜0.05;5.0μmol/L組和10.0μmol/L組LDH活力與2.5μmol/L組、20.0μmol/L組LDH活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;2.5μmol/L組和20.0μmol/L組與空白對(duì)照組比較LDH活性降低，P＜0.

15、05。6.MDA濃度檢測(cè)5.0μmol/L組和10.0μmol/L組與損傷組比較MDA濃度降低，P＜0.05;損傷組與空白對(duì)照組比較MDA濃度升高，P＜0.05;5.0μmol/L組和10.0μmol/L組MDA濃度與2.5μmol/L組、20.0μmol/L組MDA濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;2.5μmol/L組和20.0μmol/L組與空白對(duì)照組比較MDA濃度升高，P＜0.05。7.免疫組化、免疫熒光、PCR檢測(cè)與損傷

16、對(duì)照組比較，5.0μmol/L組、10.0μmol/L組HO-1表達(dá)升高，nNOS表達(dá)降低，P＜0.05;損傷組與空白對(duì)照組比較HO-1表達(dá)下降，nNOS表達(dá)升高，P＜0.05;5.0μmol/L組和10.0μmol/L組HO-1、nNOS的表達(dá)與2.5μmol/L組、20.0μmol/L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;2.5μmol/L組、20.0μmol/L組與損傷組比較HO-1、nNOS的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05