姜黃素誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增強(qiáng)人臍靜脈血內(nèi)皮祖細(xì)胞活力及抗氧化損傷能力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:體外分離、培養(yǎng)及鑒定人臍靜脈血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)。探討姜黃素(Curcumin, CMN)誘導(dǎo)EPCs表達(dá)血紅素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)增強(qiáng)自身細(xì)胞活力及抗氧化損傷能力的作用及機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)研究分為四部分:1.人臍靜脈血EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定:采用密度梯度離心法分離、培養(yǎng)人臍靜脈血EPCs,通過倒置相差顯微鏡下觀察EPCs形態(tài)學(xué)變化,免疫熒光法觀察EPCs吸收Dil-ac-L

2、DL和FITC-UAE-1情況并對7d的EPCs進(jìn)行CD133免疫熒光鑒定。2.CMN的細(xì)胞毒性作用及誘導(dǎo)EPCs表達(dá)HO-1的效果評價:將培養(yǎng)的EPCs分為A、B、C、D四組,分別以終濃度為0、5、10、15μmol/L CMN的培養(yǎng)基孵育24h,CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖活力、比色法檢測各組培養(yǎng)液中LDH活力,分析 CMN對EPCs是否具有細(xì)胞毒性作用。Western blot檢測各組細(xì)胞HO-1表達(dá)量,明確CMN誘導(dǎo)EPCs表達(dá)H

3、O-1的作用以及選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需CMN的最佳濃度。3.CMN誘導(dǎo)EPCs表達(dá)HO-1的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究:將培養(yǎng)的EPCs分為A、B、C三組,分別在單純培養(yǎng)基、終濃度15μmol/L CMN的培養(yǎng)基、終濃度15μmol/L CMN+1μmol/L全反式視磺酸(ATRA)的培養(yǎng)基中孵育24h。Western blot檢測各組細(xì)胞HO-1表達(dá)量,探討CMN誘導(dǎo)EPCs表達(dá)HO-1的信號機(jī)制。4.CMN誘導(dǎo)EPCs表達(dá)HO-1增強(qiáng)自身細(xì)胞

4、活力及抗氧化損傷能力的作用及機(jī)制研究:將培養(yǎng)的EPCs分為A、B、C、D四組,分別在單純培養(yǎng)基、終濃度15μmol/L CMN的培養(yǎng)基、終濃度500μmol/L H2O2+15μmol/L CMN的培養(yǎng)基、終濃度500μmol/L H2O2+15μmol/L CMN+10μmol/L鋅原卟啉(ZnPPIX)的培養(yǎng)基中孵育24h。CCK-8檢測各組細(xì)胞活力、比色法檢測各組培養(yǎng)液中LDH活力、ELISA法檢測各組培養(yǎng)液中的血管內(nèi)皮生長因子(

5、VEGF)和人堿性成纖維生長因子(bFGF)活力、AnnexinV-FTTC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。明確CMN增強(qiáng)EPCs活力及抗氧化損傷能力的作用及機(jī)制。
　　結(jié)果:1.從臍靜脈分離出來的單核細(xì)胞培養(yǎng)3-4d開始貼壁;7d后有一定方向性,呈簇狀生長;大約9d時出現(xiàn)多個血島樣細(xì)胞團(tuán)。表面標(biāo)記 CDl33免疫熒光檢測顯示綠色陽性率>90％,免疫熒光鑒定顯示>90％的貼壁細(xì)胞呈雙熒光染色陽性。2.以終濃度分別為0、5、

6、10、15μmol/L的CMN孵育的各組EPCs,細(xì)胞增殖活力分別為(0.743±0.250)、(0.810±0.135)、(0.854±0.374)、(0.895±0.193),組間比較有顯著差異(P<0.05),表明EPCs的增殖活力隨CMN濃度的升高而明顯升高;LDH活力分別為(732.4±45.2)、(728.1±35.8)、(745.7±48.6)、(750.2±47.3),組間比較無差異(P>0.05),表明CMN對EPCs

7、無明顯毒性作用;代表HO-1表達(dá)量的光密度比值分別為(0.65±0.02)、(0.87±0.08)、(1.25±0.05)、(1.34±0.03),組間比較顯著差異(P<0.05),表明EPCs表達(dá)HO-1的量隨CMN濃度的升高而升高。3.實(shí)驗(yàn)3中A、B、C三組測得的代表HO-1表達(dá)量的光密度比值分別為(0.47±0.04)、(1.43±0.02)、(1.11±0.05),B組明顯高于與A組與C組(均為P<0.05)。4.實(shí)驗(yàn)4的A、B

8、、C、D四組中,細(xì)胞增殖活力分別為(0.752±0.238)、(0.640±0.119)、(0.724±0.450)、(0.681±0.309);VEGF分別為(40.52±2.63)、(15.81±3.24)、(31.43±2.90)、(20.74±2.16);bFGF分別為(80.32±3.58)、(49.64±4.73)、(65.29±5.12)、(54.17±4.98),上述3項(xiàng)指標(biāo)的組間比較顯示,B,C、D組均明顯低于A組(均

9、為P<0.05),其中,B、D組又低于C組(均為P<0.05),而B、D兩組間則無明顯差異(P>0.05)。各組LDH活力分別為(511.2±58.6)、(830.4±54.3)、(725.8±49.4)、(795.6±58.7);細(xì)胞凋亡率分別為(1,95±0.83)、(25.07±2.54)、(17.03±2.04)、(22.55±1.98),上述2項(xiàng)指標(biāo)的組間比較顯示,B,C、D組均明顯高于A組(均為P<0.05),其中,B、D組