JNK通路介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┮呀?jīng)成為威脅人類健康的三大殺手之一，也是影響人們生活質(zhì)量的最常見、嚴(yán)重的心血管疾病之一。研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，在動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)有大量的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)非常明顯;在冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，不論是從脂質(zhì)條紋到粥樣斑塊或纖維斑塊，還是不穩(wěn)定斑塊的生成、破裂、血栓形成，始終都有各種炎癥細(xì)胞的參與。由此可見，抑制

2、炎癥細(xì)胞活性，通過(guò)免疫調(diào)節(jié)阻斷炎癥反應(yīng)通路已成為研究及治療冠心病的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。眾所周知，炎癥反應(yīng)的活化與T淋巴細(xì)胞明顯相關(guān)，而近年研究表明，負(fù)性刺激信號(hào)（PD-1/PD-L1）對(duì)T淋巴細(xì)胞活化起重要作用。
　　 JNK又稱c-Jun N-末端激酶或者應(yīng)激活化的蛋白激酶(stress activiatedprotein kinase，SAPK)，是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase

3、，MAPK)超家族成員之一，是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于細(xì)胞胞質(zhì)之中，相對(duì)分子量為46×103和54×103，存在特定的功能區(qū)(Thr-Pro-Tyr)，其編碼基因?yàn)镴NK1、JNK2和JNK3，其中JNK1和JNK2存在于全身各組織中，而JNK3主要存在于腦、心臟和睪丸等組織。JNK的活化是通過(guò)氨基末端殘基磷酸化實(shí)現(xiàn)的，而JNK的激活可以受多種細(xì)胞外因素的刺激而啟動(dòng)，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-1、TNF-α等）、應(yīng)激

4、刺激（紫外線、細(xì)胞高滲透壓、缺血再灌注損傷）等。一旦JNK激活，JNK將由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中，廣泛參與細(xì)胞凋亡、增殖、代謝及DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)反應(yīng)，而其功能的失調(diào)可造成神經(jīng)退行性病變、缺血再灌注損傷、糖尿病和腫瘤等多種疾病。
　　 程序性死亡因子配體1（programmed cell death ligand1，B7-H1、CD274或PD-L1）是由290個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-L1是B7家族分子的重要成員，

5、它的受體既不是CTLA-4蛋白（cytotoxic T-lymphocyte Antigen4，CTLA-4），也不是ICOS蛋白（inducible co-stimulator，ICOS）和CD28蛋白，其受體為程序性死亡因子1（programmed cell death1 receptor，CD279或PD-1）。在最初的研究中發(fā)現(xiàn)，PD-L1在腫瘤細(xì)胞中有高表達(dá)，因此，人們推測(cè)PD-L1可能與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān);但近年研究表明，除腫

6、瘤細(xì)胞以外，PD-L1在許多炎癥細(xì)胞上均有表達(dá)，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、星形細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞等等;PD-L1的功能除與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)明顯相關(guān)以外，還與多種疾病發(fā)生有密切的關(guān)系，如移植免疫反應(yīng)、微生物感染（病毒感染）、自身免疫性疾病，近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)與動(dòng)脈粥樣斑塊形成也明顯有關(guān)。Gotsman等用熒光免疫技術(shù)研究冠狀動(dòng)脈時(shí)發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)于多處動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)。Lee等研究

7、也發(fā)現(xiàn)，冠心病患者較正常人相比，T淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)均顯著降低，而T淋巴細(xì)胞增殖能力卻增強(qiáng)，證實(shí)PD-L1/PD-1與致動(dòng)脈粥樣硬化性T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)有著密切聯(lián)系，能夠負(fù)性信號(hào)調(diào)控冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊形成，在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。雖然現(xiàn)在對(duì)PD-L1的功能有了一定了解，但對(duì)于PD-1/PD-L1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制目前尚不明了。不同研究對(duì)象及使用不同刺激物所得出結(jié)果不完全相同，總的來(lái)說(shuō)，影響PD-

8、L1表達(dá)的細(xì)胞信號(hào)通路可能為PI3K/Akt信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路、NPM/ALK通路、MEK/Erk信號(hào)通路，以及與STAT-3和IRF-1轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。眾所周知，JNK信號(hào)通路是MAPK通路的重要分支，它能通過(guò)細(xì)胞外刺激誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡的發(fā)生。然而關(guān)于PD-L1蛋白表達(dá)與JNK信號(hào)通路的關(guān)系的研究資料甚少。
　　 鑒于以上證據(jù)，本課題以體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用炎癥因子(LPS)刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模

9、擬病原微生物入侵的模型，觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1表型的變化;再以JNK蛋白特異性抑制劑SP600125阻斷JNK通路，探討臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1與JNK信號(hào)通路的關(guān)系，闡明LPS誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1蛋白的分子機(jī)制，完善負(fù)性協(xié)同刺激信號(hào)（PD-1/PD-L）調(diào)控T淋巴細(xì)胞活性的機(jī)理，有望為動(dòng)脈粥樣硬化的免疫治療的提供新的思路及理論基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1.LPS能否誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L

10、1。
　　 2.以JNK蛋白特異性抑制劑SP600125阻斷JNK信號(hào)通路后，觀察樹突狀細(xì)胞受炎癥因子刺激后PD-L1表型變化，探討樹突狀細(xì)胞表達(dá)PD-L1與JNK信號(hào)通路的關(guān)系。
　　 對(duì)象和方法：
　　 1.對(duì)象
　　 體外培人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 2.方法
　　 2.1 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、鑒定及傳代培養(yǎng)無(wú)菌條件下，取健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)后新鮮的胎兒臍帶，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液

11、清洗，用Ⅰ型膠原酶消化、離心，加入含20％胎牛血清的M199培養(yǎng)液，放入5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)中37℃培養(yǎng)。24h后換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)鋪滿瓶底80％-90％，以0.125％胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，選擇生長(zhǎng)良好的第4～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用形態(tài)學(xué)和內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ相關(guān)抗原進(jìn)行鑒定。
　　 原代的細(xì)胞一般培養(yǎng)4-5天后細(xì)胞可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底95％以上，顯微鏡下觀察細(xì)胞融合成單層呈鋪路石狀，此時(shí)可傳代。棄去培養(yǎng)瓶中舊

12、培養(yǎng)液，用PBS（37℃預(yù)熱20分鐘）洗滌2-3次，加入1ml0.125％的胰蛋白酶（37℃預(yù)熱20分鐘）室溫消化細(xì)胞20s，顯微鏡下觀察細(xì)胞皺縮變圓、彼此分離即可將胰蛋白酶吸出，然后加入M199完全培養(yǎng)液終止消化，吸管輕柔吹打至均勻細(xì)胞懸液，按1∶2傳代培養(yǎng)。
　　 2.2 程序降溫法凍存內(nèi)皮細(xì)胞，快速融化法復(fù)蘇細(xì)胞
　　 2.2.1 內(nèi)皮細(xì)胞的凍存用一次性吸管吸去培養(yǎng)瓶中廢棄的培養(yǎng)液，再用PBS洗滌細(xì)胞2次。以0.1

13、25％胰酶消化20秒，顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓、皺縮。用一次性吸管吸出胰酶，凍存液加入培養(yǎng)瓶中終止消化。彎頭吸管吹打瓶中細(xì)胞數(shù)分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞全部脫落。再將細(xì)胞懸液加入凍存管中，標(biāo)記日期、細(xì)胞種類，封口膠封口。
　　 細(xì)胞程序降溫:4℃冰箱20分鐘→-20℃冰箱1小時(shí)→-70℃冰箱過(guò)夜→次晨投入液氮罐。
　　 2.2.2 內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇用鑷子從液氮罐中取出標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞的凍存管，將其迅速放入37℃水浴箱中充分搖晃至凍存管

14、中細(xì)胞完全解凍（大約1分鐘）。用酒精擦拭凍存管后入超凈工作臺(tái)。在15ml離心管中預(yù)先加入3倍凍存細(xì)胞體積的M199完全培養(yǎng)基，用一次性吸管將細(xì)胞液吸出加入離心管中混勻。低速離心:300rpm離心5分鐘或500rpm離心3分鐘。去上清，加培養(yǎng)液培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶置入孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行傳代。
　　 2.3 實(shí)驗(yàn)分組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次）
　　 收獲第五代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/ml，接種于6

15、孔培養(yǎng)板中。根據(jù)是否使用LPS和JNK蛋白特異性抑制劑SP600125將實(shí)驗(yàn)分成三組:陰性對(duì)照組、LPS組和SP600125+LPS組(LPS及SB203580均用二甲基亞砜(DMSO)溶解）
　　 第一組為陰性對(duì)照組(NORMAL):將未加入任何藥物的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)作為陰性對(duì)照。
　　 第二組為L(zhǎng)PS刺激組(LPS):首先在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中加入DMSO(0.1％V/V)作用1小時(shí)，再加入LPS(1.0μg/ml)繼續(xù)培

16、養(yǎng)24小時(shí)(LPS每12 h半量換液);
　　 第三組為SP600125+LPS共刺激組:首先在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中加入SP600125(20μmol/L)作用1h后再用LPS刺激24 h(LPS每12 h半量換液)。
　　 2.4 Western blot檢測(cè)PD-L1蛋白自6孔培養(yǎng)板中提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液抽提全細(xì)胞蛋白樣品，并經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5％

17、的脫脂奶粉封閉2h，加入抗PD-L1多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜后加入二抗，37℃孵育2h后ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影、定影。QuantityOne凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值。
　　 2.5 Western blot檢測(cè) P-JNK、JNK蛋白自6孔培養(yǎng)板中提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液抽提全細(xì)胞蛋白樣品，并經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5％的脫脂奶

18、粉封閉2h，加入抗p-JNK多克隆抗體和抗JNK多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜后加入二抗，37℃孵育2h后ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值，以p-JNK/JNK蛋白光密度的比值代表p-JNK的光密度值，分別算出陰性對(duì)照組、LPS組、SP600125+LPS組光密度的比值。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x

19、)±S)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.結(jié)果
　　 4.1 MTT檢測(cè)HUVECs增殖各組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞OD值測(cè)定。陰性對(duì)照組OD值為0.32±0.003，LPS組OD值為0.34±0.033，SP600125+LPS組OD值為0.31±0.018，各組OD值比較P＞0.05，各組細(xì)胞增殖無(wú)顯著差異。

20、r>　　 4.2 Western blot檢測(cè) PD-L1蛋白Western blot曝光灰度掃描結(jié)果（Z值）顯示，LPS組為1.12±0.72，SP600125+LPS組為0.66±0.36，對(duì)照組為0.59±0.30。SP600125+LPS組與對(duì)照組Z值均小于LPS組（P＜0.05或P＜0.05)，SP600125+LPS組Z值與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 4.3 Western blot檢測(cè)JNK、P

21、-JNK蛋白Western blot曝光灰度掃描結(jié)果（Z值）顯示，LPS組為1.26±0.09，SP600125+LPS組為0.49±0.18，對(duì)照組為0.95±0.21。SP600125+LPS組Z值均小于其它2組（P＜0.05或P＜0.05)，LPS組Z值顯著大于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.LPS可以誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1表達(dá)增高;
　　 2.JNK信號(hào)通路可能參與調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細(xì)