PD-L1高表達的間質(zhì)細胞通過誘導免疫耐受促進腫瘤生長的實驗研究.pdf

1、目的：前期的實驗研究證明一定量的化療藥物,如順鉑處理腫瘤細胞之后,腫瘤細胞上 PD-L1的表達水平增高,這也是順鉑對于惡性腫瘤的治療預后不好的原因之一。順鉑是不是也可以誘導腫瘤微環(huán)境中纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等的PD-L1的表達量上升導致腫瘤微環(huán)境的免疫耐受,使惡性腫瘤繼續(xù)發(fā)生、發(fā)展?本研究通過基因工程技術(shù)構(gòu)建表達 mPDLl真核表達載體,在 L929細胞中穩(wěn)定高表達,通過PD-L1轉(zhuǎn)基因細胞的構(gòu)建及其功能的研究進一步探討PD-L1信號發(fā)

2、揮作用的分子機制及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。
　　方法：(1)不同濃度的化療藥物 DDP處理L929細胞,流式細胞技術(shù)檢測 PD-L1在 L929細胞上表達水平;(2)PCR方法擴增得到小鼠的PD-L1全長片段,以pcDNA3.1(+)真核表達質(zhì)粒為載體,構(gòu)建得到重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠成纖維細胞(L929),通過 G418篩選得到高表達PD-L1的穩(wěn)定細胞株并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(

3、Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、細胞免疫熒光、流式細胞術(shù)鑒定。用絲裂霉素處理過的PD-L1高表達細胞與小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng),流式細胞術(shù)檢測 PD-L1對淋巴細胞增殖作用的影響。(3)動物實驗分組:實驗組(混合接種了B16細胞和L929-pcDNA3.1(+)-PDL1細胞的小鼠)、對照組1(單獨接種 B16細胞)、對照組2(混合接種 B16細胞和L929-

4、pcDNA3.1(+)細胞)、對照組3(混合接種滅活 B16細胞和L929-pcDNA3.1(+)-PDL1細胞)。按實驗分組將細胞混合腋下接種昆明小鼠,在動物水平觀察間質(zhì)細胞中PD-L1表達水平的改變對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響并測定免疫學指標。
　　結(jié)果：(1)分別以2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml DDP刺激 L929細胞之后,L929細胞上的PD-L1的表達水平增高。但以更低劑量的DDP刺激 L929細胞之后無PD-

5、L1表達水平的改變。(2)PCR方法獲得小鼠PD-L1全長基因,通過 EcoRI/XhoI雙酶切及測序證實構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1正確;轉(zhuǎn)染細胞經(jīng) G418篩選后獲得穩(wěn)定表達 mPD-L1的L929細胞株:RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-PDL1質(zhì)粒的L929細胞出現(xiàn)約900bp條帶(mPD-L1 mRNA的表達),對照組無目的條帶出現(xiàn);熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-PDL1質(zhì)粒的

6、L929細胞可見紅色熒光,表明有 PD-L1蛋白的表達,陰性對照細胞(轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的L929細胞)未見紅色熒光;流式細胞術(shù)鑒定轉(zhuǎn)染空載 pcDNA3.1(+)的L929細胞相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-PD-L1的細胞的熒光值明顯增高,確定重組質(zhì)粒在 L929細胞中高效表達。(3)PD-L1抑制小鼠脾淋巴細胞的增殖。(4)小鼠的腫瘤生長率實驗組較對照組快;實驗組小鼠血清使雞血紅細胞溶血率顯著降低,間接反映小鼠機體

7、免疫能力較對照組小鼠降低了;實驗組小鼠脾臟 NK細胞對 B16細胞的殺傷活性較對照組降低;實驗組小鼠淋巴細胞增殖能力較對照組減弱。
　　結(jié)論：(1)低劑量 DDP刺激 L929細胞可以上調(diào)其 PD-L1表達量;(2)成功構(gòu)建真核表達質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1;(3)建立穩(wěn)定表達 mPD-L1的L929細胞株L929-pcDNA3.1(+)-PDL1且有生物學活性;(4)動物實驗證實間質(zhì)細胞中PD-L1高表達形成的免疫