細(xì)胞毒性T細(xì)胞聯(lián)合PD-L1單抗對肺癌免疫治療的實驗研究.pdf

1、第一部分：細(xì)胞毒性T細(xì)胞聯(lián)合PD-L1單抗對肺癌作用的體外研究 目的： 通過誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，觀察CTL單獨或聯(lián)合PD-L1單抗對肺癌細(xì)胞的體外殺傷作用。 方法： 采用70％Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法獲得外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，培養(yǎng)2小時后貼壁細(xì)胞采用含

2、GM-CSF(100μg/L)、IL-4(50μg/L)、10％FCS的RPM11640誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)，培養(yǎng)第6天，采用凋亡的H1299肺癌細(xì)胞進行腫瘤抗原負(fù)載(DCs：凋亡細(xì)胞=5：1)，24 h后加入激發(fā)型CD40單克隆抗體(5mg/L)繼續(xù)誘導(dǎo)2d，收集誘導(dǎo)成熟的DCs與自體T細(xì)胞按1：50的比例混合共育4天，獲得相關(guān)抗原特異性的CTL細(xì)胞；用流式細(xì)胞儀檢測CTL細(xì)胞表型；四甲基偶氮唑藍(lán)(

3、MMT)法測定CTL及CTL聯(lián)合PD-L1單抗對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用；用Annexin-V、PI雙染檢測CTL單獨及聯(lián)合PD-L1單抗作用于H1299細(xì)胞的凋亡作用，Annexin-V聯(lián)合CD3-PE單抗檢測H1299細(xì)胞單獨或聯(lián)合PD-L1單抗對CTL細(xì)胞的凋亡作用；ELISA法檢測不同組別CTL和H1299共培養(yǎng)上清液中IFN-γ，IL-2濃度。 結(jié)果： 1.凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載并經(jīng)CD40激發(fā)型單抗5C11誘導(dǎo)分化成熟

4、的DCs表面CD1α、CD83、HLA-DR表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；2.與單獨CTL組相比，CTL聯(lián)合PD-L1單抗實驗組能夠更有效殺傷H1299細(xì)胞并能有效地誘導(dǎo)H1299細(xì)胞凋亡，CTL組及CTL聯(lián)合PD-L1單抗組H1299凋亡率分別為(41.9±9.8)％、(63.2±11.7)％，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；進一步研究發(fā)現(xiàn)PD-L1單抗聯(lián)合CTL細(xì)胞促進CTL細(xì)胞分泌IL-2(162.3±20)pg/ml，與單純C

5、TL組(115.38±12.23)pg/ml相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 1.采用成熟凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載的DC獲得的CTL可有效殺傷H1299肺癌細(xì)胞，聯(lián)合PD-L1單抗較單獨CTL更為有效的殺傷肺癌細(xì)胞； 2.通過上述方法獲得的CTL在H1299細(xì)胞作用下發(fā)生凋亡作用，聯(lián)合PD-L1單抗可抑制H1299誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞的凋亡； 3.CTL聯(lián)合PD-L1單抗可促進CTL細(xì)胞分泌IL-2。

6、 第二部分：細(xì)胞毒性T細(xì)胞聯(lián)合PD-L1單抗對肺癌作用的體內(nèi)研究 目的： 觀察細(xì)胞毒性T細(xì)胞單獨或聯(lián)合PD-L1單抗對裸鼠肺癌移植瘤模型的免疫治療作用。 方法： 建立人肺癌裸鼠異種移植瘤模型，荷瘤裸鼠隨機分為4組：1.生理鹽水治療組； 2. PD-L1單抗治療組；3.CTL治療組；4.CTL聯(lián)合PD-L1單抗治療組，觀察荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤生長情況及體積大?。粰z測裸鼠血清中IL-10，IL-2

7、水平的變化。 結(jié)果： 1.在第51天，生理鹽水治療組、PD-L1組、CTL組、CTL+PD-L1單抗聯(lián)合組荷瘤裸鼠腫瘤體積分別為(1.39±0.63)cm3、(1.53±0.71)cm3、(0.63±0.26)cm3和(0.16±0.03)cm3； CTL組、CTL+PD-L1單抗聯(lián)合組腫瘤生長明顯受抑制，與生理鹽水組，PD-L1組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；CTL聯(lián)合PD-L1單抗組比CTL組腫瘤體積縮小更

8、為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 2.生理鹽水治療組、PD-L1組、CTL組、CTL+PD-L1單抗聯(lián)合組IL-2水平分別為(160.5±44.9)pg/ml、(133.4±46.2)pg/ml、(321.1±24.1)pg/ml、(469.4±8.5)pg/ml，CTL組和CTL聯(lián)合PD-L1單抗組IL-2水平明顯升高，與生理鹽水組，PD-L1組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；IL-10水平分別為(556.4

9、±94.5)pg/ml、(485.5±33.4)pg/ml、(335.9±27.3)pg/ml、(288.5±33.4)pg/ml，CTL組和CTL聯(lián)合PD-L1單抗組IL-10水平明顯降低，與生理鹽水組、PD-L1組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 結(jié)論： CTL聯(lián)合PD-L1單抗較CTL治療組能有效抑制荷瘤裸鼠異種移植瘤的生長，腫瘤細(xì)胞分泌IL-10可能抑制了CTL的殺傷作用，PD-L1單抗可逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)，促