肝癌微波消融聯(lián)合細(xì)胞免疫治療的實(shí)驗(yàn)及臨床初步研究.pdf

1、肝癌是臨床進(jìn)展較快的惡性腫瘤，目前主要治療方法為手術(shù)切除、肝移植、局部消融及經(jīng)動(dòng)脈介入治療。局部消融治療小肝癌的遠(yuǎn)期療效與手術(shù)切除相當(dāng)，已被公認(rèn)為是繼手術(shù)和肝移植之后的根治性治療方法之一，然而仍迫切需要探索新的療法，以解決高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率的難題。近20年來，過繼性細(xì)胞免疫治療發(fā)展迅速，有望成為肝癌的有效輔助治療方法之一。
　　 目的:摸索微波消融治療時(shí)有效滅活腫瘤細(xì)胞并釋放腫瘤抗原的溫控和能量條件；觀察肝癌消融后局部注射未成熟樹突狀

2、細(xì)胞對(duì)荷瘤小鼠生存期及腫瘤生長(zhǎng)的影響；觀察肝癌微波消融聯(lián)合樹突狀細(xì)胞疫苗及效應(yīng)細(xì)胞綜合過繼免疫治療的臨床安全性，研究微波聯(lián)合細(xì)胞免疫治療后近期外周血淋巴亞群比例及細(xì)胞因子濃度的變化，初步探討細(xì)胞免疫治療對(duì)肝癌微波消融后近期復(fù)發(fā)率的影響。
　　 材料與方法:
　　 1.模擬肝癌微波治療中常用消融區(qū)邊緣的溫控和能量條件，消融人肝細(xì)胞癌株SMMC-7721細(xì)胞懸液，分為五組：A、對(duì)照組，B、45℃10min組，C、50℃3mi

3、n組，D、54℃3min組，E、60℃即刻組，消融后30分鐘及2小時(shí)進(jìn)行凋亡檢測(cè)。
　　 2.32只C57小鼠左例腹股溝皮下接種Hepal-6鼠肝癌細(xì)胞瘤塊作為消融瘤，間隔1周，右側(cè)腹股溝皮下接種瘤塊作為觀察瘤，成瘤后分為四組：A組，對(duì)照組，不行治療；B組，微波組，僅微波消融小鼠消融瘤；C組，成熟DC組(mDc組)，微波消融小鼠消融瘤，并于小鼠雙側(cè)腋下注射腫瘤抗原致敏的樹突狀細(xì)胞；D組，未成熟DC組(iDC組)，微波消融小鼠消融

4、瘤，并于消融瘤周注射未成熟樹突狀細(xì)胞。觀察瘤均不予處理，荷瘤后每7—8天測(cè)量瘤體大小，直至小鼠死亡。
　　 3.知情同意原則下，10例行根治性微波消融聯(lián)合多種免疫細(xì)胞過繼治療的原發(fā)性肝癌患者納入聯(lián)合組，同期符合相同入組條件的121例微波治療患者納入微波組。聯(lián)合組患者免疫治療方案設(shè)計(jì)為三個(gè)療程，治療前抽血45ml用于分離培養(yǎng)DC和效應(yīng)細(xì)胞，在超聲造影引導(dǎo)下回輸?shù)礁蝺?nèi)消融區(qū)與充血帶交界區(qū)或在超聲引導(dǎo)下回輸?shù)礁构蓽狭馨徒Y(jié)內(nèi)及右上腹腹腔

5、內(nèi)。10例聯(lián)合組及24例微波組患者還于治療前及治療后1、3、6個(gè)月進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外實(shí)驗(yàn)：受微波熱損傷細(xì)胞主要表現(xiàn)為死亡，凋亡細(xì)胞比例??；在各溫控和能量條件下，隨溫度升高，存活細(xì)胞百分比降低，消融后2h與30min比，各消融組存活細(xì)胞比例顯著降低，其中60℃即刻組94.36％細(xì)胞均死亡或凋亡，其它組仍有較多存活細(xì)胞。
　　 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：消融后12天，各治療組消融

6、瘤最大徑均顯著小于對(duì)照組，但治療組問無顯著差異，觀察瘤最大徑亦顯著小于對(duì)照組且iDC組明顯小于mDC組(p<0.05)；各治療組小鼠觀察120天，消融瘤原位滅活率均為37.5％，iDC組(87.5％)及mDc組(75％)觀察瘤消失率均高于單純微波組(62.5％)，iDC組最高；與對(duì)照組相比，各治療組小鼠生存期顯著延長(zhǎng)，iDC組最長(zhǎng)；iDC組及mDC組生命延長(zhǎng)率高于單純微波治療組，iDC組最高。
　　 3.臨床研究：微波聯(lián)合免疫治

7、療54次細(xì)胞回輸未出現(xiàn)II級(jí)以上嚴(yán)重不良反應(yīng)，治療后1、3、6個(gè)月患者血常規(guī)、肝腎功能及凝血功能與治療前比較均無顯著差異?；颊呓?jīng)微波消融聯(lián)合免疫治療后1、3、6個(gè)月，外周血CD8+CD28+淋巴細(xì)胞亞群百分比較治療前升高并顯著高于微波組，CD4+/CD8+較治療前降低并顯著低于微波組；治療后1和3個(gè)月，CD8+CD28-效應(yīng)細(xì)胞亞群百分比較治療前顯著升高；治療后1個(gè)月，CD4+CD25highTreg細(xì)胞百分比較治療前顯著降低，并顯著低

8、于微波組，治療后3和6個(gè)月時(shí)，雖仍低于治療前但有所回升，且與消融組無差異。治療后1個(gè)月，聯(lián)合組IL-2濃度及IL-2/IL-4值較治療前增高，治療后3和6個(gè)月時(shí)回落。聯(lián)合組患者治療后3-9月內(nèi)局部腫瘤進(jìn)展率及肝內(nèi)復(fù)發(fā)或肝外轉(zhuǎn)移率均較微波組有降低趨勢(shì)，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。聯(lián)合治療后1個(gè)月，57.14％患者產(chǎn)生了病毒應(yīng)答。
　　 結(jié)論
　　 1)微波消融腫瘤細(xì)胞達(dá)到60℃，靜置2小時(shí)，94.36％腫瘤細(xì)胞死亡或凋亡，推測(cè)該溫控

9、條件及時(shí)間點(diǎn)是消融區(qū)邊緣未成熟樹突狀細(xì)胞回輸治療的較好選擇；
　　 2)肝癌微波消融聯(lián)合消融區(qū)邊緣注射未成熟DC，可延長(zhǎng)小鼠生存期，并可使遠(yuǎn)處腫瘤灶明顯縮小甚至消退；
　　 3)微波消融聯(lián)合樹突狀細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞過繼免疫治療肝癌在臨床實(shí)施中是安全的；
　　 4)聯(lián)合治療改善了機(jī)體免疫狀態(tài)，并可實(shí)現(xiàn)較高的病毒應(yīng)答率，但是持續(xù)時(shí)間有限，提示現(xiàn)有治療方案需要縮短時(shí)間間隔、增加療程，并有必要進(jìn)行抗病毒免疫治療改善患者整體免