PSMA在肺癌表達及免疫治療臨床應用價值的初步研究.pdf

1、研究目的:
　　研究前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)在肺癌組織的腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞上的表達情況。分析PSMA在肺癌中表達情況與患者的年齡、性別、病理類型、腫瘤大小、臨床分期等因素的關系。構建AAV/PSMA質(zhì)粒，制備AAV/PSMA病毒，用AAV/PSMA病毒轉染樹突狀細胞，誘導生成細胞毒性T淋巴細胞。
　　研究方法:
　　1.從天津醫(yī)科大學附屬腫

2、瘤醫(yī)院標本庫選取非小細胞肺癌標本87例（包括鱗癌30例、腺癌29例、大細胞癌28例），小細胞肺癌30例，正常肺組織標本33例。這些標本同時用PSMA抗體和CD31抗體進行了免疫組化。免疫組化的陽性對照選擇前列腺癌組織，陰性對照選用PBS。
　　2.復蘇培養(yǎng)擴增高表達目的基因PSMA的LNcap細胞。用Trizol法從高表達目的基因的LNcap細胞中提取總RNA。用mRNA抽提試劑盒從總RNA中抽提mRNA。RT-PCR方法將mRN

3、A逆轉錄為cDNA并將逆轉錄的cDNA進行擴增。利用QIAGEN公司的凝膠抽提試劑盒抽提凝膠中的目的基因。用T4連接酶將目的基因與腺相關病毒載體進行連接。將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細胞混合進行轉化和涂菌。挑選生長良好的單克隆菌落用LB培養(yǎng)基進行擴增培養(yǎng)。單克隆菌落擴增之后進行質(zhì)粒抽提。抽提的AAV/PSMA質(zhì)粒分別用PCR和基因測序兩種方法進行驗證并與GenBank公開的PSMA序列對比吻合。無腺病毒參與的包裝系統(tǒng)制備AAV/PSMA病毒。

4、r>　　3.AAV/PSMA轉染DC并誘導生成CTL
　　取健康人外周血，采用密度梯度離心的方法分離外周血單個核細胞PBMC。取無菌10cm培養(yǎng)皿，按約8×107～12×107個細胞/皿，將PBMC加入培養(yǎng)皿中，補充AIM-V培養(yǎng)液。置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，37℃，5％CO2，3小時。3小時后加入AAV/PSMA病毒，繼續(xù)培養(yǎng)8小時。8小時后將懸浮的T淋巴細胞轉移至T75或以上的細胞培養(yǎng)瓶中。根據(jù)懸浮細胞密度，決定需要培養(yǎng)液體積和細

5、胞培養(yǎng)瓶的數(shù)量。培養(yǎng)瓶中加入細胞因子白介素-2，置二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃，5％CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)皿底部貼壁細胞為樹突狀細胞。培養(yǎng)皿中加入AIM-V培養(yǎng)基、重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和白細胞介素-4。第六天將DC和淋巴細胞混合培養(yǎng)（DC∶淋巴細胞為1∶20）。混合培養(yǎng)階段應每天在倒置顯微鏡下觀察細胞集落情況，若觀察到細胞集落稍有松散，則可判定細胞毒性T淋巴細胞(CTL)已經(jīng)被激活，CTL細胞培養(yǎng)完成。
　　流式細胞儀檢測樹突狀細

6、胞的表型CD83、CD80和CD86; CTL抗腫瘤殺傷活性的檢測:用帶熒光標記的CD4、CD8、CD25、CD69抗體標記CTL細胞，以流式細胞儀進行檢測，得到所培養(yǎng)的CTL細胞中CD4+CD8+、CD25+CD4+、CD69+CD8+的表達情況;用FITC-anti-IFN-γ標記CTL，以流式細胞儀檢測，得到CTL細胞中IFN-γ的表達情況。用不同MOI的病毒轉染DC并用流式細胞儀進行檢測，得到AAV/PSMA病毒轉染DC的最佳M

7、OI數(shù)值。
　　研究結果：
　　1.在非小細胞肺癌中，PSMA在腫瘤細胞上的陽性表達率為54.02％，在腫瘤血管內(nèi)皮細胞上的陽性表達率為85.06％;在小細胞肺癌中，腫瘤細胞上沒有PSMA陽性表達，在腫瘤血管內(nèi)皮細胞上PSMA陽性表達率為73.33％;在與腫瘤相鄰的正常肺組織上沒有發(fā)現(xiàn)PSMA表達。
　　2.成功構建AAV/PSMA質(zhì)粒并制備AAV/PSMA病毒;經(jīng)PCR驗證，構建的質(zhì)粒中成功插入PSMA基因，長度為7

8、20bp;樹突狀細胞中CD80、 CD83和CD86的表達比例分別為54％、83％和72％; CTL中CD8/CD4為1.12，CD25+CD4+、CD69+CD8+和IFN-γ的表達分別為9.052％、42.76％和39％。
　　研究結論：
　　PSMA特異性的表達于非小細胞肺癌的腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞;PSMA特異性表達于小細胞肺癌的腫瘤血管內(nèi)皮細胞而不表達于腫瘤細胞;與腫瘤相鄰的正常肺組織無PSMA表達;PSMA可能成