臍血CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療中晚期肺癌病人的臨床研究.pdf

1、目的與背景: 肺癌是最常見的惡性腫瘤。目前，手術(shù)切除仍然是肺癌的主要治療手段。但是在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的肺癌患者中約80％在診斷時(shí)已屬晚期或有轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，放化療技術(shù)近年來(lái)雖有較大發(fā)展，但其治療中晚期肺癌患者仍有一定的局限性。而目前自體或臍血CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療等生物療法在抗腫瘤方面的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。有文獻(xiàn)報(bào)道臍血CIK細(xì)胞在體外的擴(kuò)增能力和殺傷活性兩個(gè)方面均優(yōu)于自體CIK細(xì)胞[1]。但是臍血CIK細(xì)胞輸入患者后

2、的療效還有待于進(jìn)一步臨床試驗(yàn)去檢驗(yàn)。本研究擬通過(guò)分離誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生CIK細(xì)胞后，將產(chǎn)生的臍血CIK細(xì)胞輸注入在本院收集的惡性腫瘤患者靜脈血進(jìn)行生物治療，進(jìn)行療效觀察。同時(shí)觀察經(jīng)過(guò)繼免疫治療后的腫瘤患者外周血的PBMC對(duì)瘤細(xì)胞(人紅白血病細(xì)胞株K562、人肝癌細(xì)胞株Hepa-CEA+及Hepa-CEA-) 的自然殺傷作用(或NK活性)，以期為臍血CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療惡性腫瘤患者的臨床療效研究提供一定依據(jù)。 方法:

3、 1．臍血CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)制備：無(wú)菌條件下采集臍血后，用Ficoll-Hypaque淋巴分離液分離出臍血單個(gè)核細(xì)胞，在該單個(gè)核細(xì)胞濃度為3-5×10<'6>/ml的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中加入INF-γ至終濃度為1000U/ml。培養(yǎng)24h后，加入IL-1、IL-2、CD3MeAb等細(xì)胞因子，使其終濃度分別為100U/ml，1000U/ml，300U/ml。隔天半量換液，保持IL-2的終濃度為1000U/ml。培養(yǎng)7天后收集CI

4、K細(xì)胞，并進(jìn)行臍血CIK細(xì)胞的計(jì)數(shù)、活度測(cè)定及其殺傷活性(或細(xì)胞毒活性)的測(cè)定。同時(shí)檢測(cè)鑒定誘導(dǎo)產(chǎn)生的臍血CIK細(xì)胞的免疫表型，并進(jìn)行臍血CIK細(xì)胞的安全性檢測(cè)。 2．臍血CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療中晚期肺癌病人：收集的臍血CIK細(xì)胞經(jīng)靜脈輸注入肺癌病人，每次輸注CIK細(xì)胞數(shù)為2～8×10<'8>，每天或隔天輸注一次，共輸注6～10次，總細(xì)胞數(shù)為2.5～6.2×10<'8>。分別于輸注CIK細(xì)胞最后一次當(dāng)天或第2天抽取4-5ml靜脈

5、血，以觀察CIK細(xì)胞療效。并于免疫治療前也分別常規(guī)采集靜脈血，分離出單個(gè)核細(xì)胞以進(jìn)行免疫功能變化檢測(cè)。 3．流式細(xì)胞術(shù)(FMC)檢測(cè)經(jīng)過(guò)繼免疫治療的肺癌病人外周血中淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化：無(wú)菌條件下采集經(jīng)臍血CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療前后的肺癌病人外周血，用Ficoll淋巴液分離出病人外周血淋巴細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)各種淋巴細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)，以觀察治療前后淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化情況。 4．MTT法檢測(cè)經(jīng)過(guò)繼免疫治療的肺癌病人外周

6、血PBMC對(duì)靶細(xì)胞 (K562、Hepa-CEA+及Hepa-CEA-細(xì)胞)的體外NK殺傷活性：于無(wú)菌條件下采集病人治療前后的外周血，用Ficoll淋巴液分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC，以此PBMC細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以K562、Hepa-CEA+及Hepa-CEA-細(xì)胞為靶細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)病人外周血PBMC對(duì)該靶細(xì)胞的NK殺傷活性。 結(jié)果: 1．臍血CIK細(xì)胞的制備：誘導(dǎo)的臍血CIK細(xì)胞具有CD3<'+>CD56

7、<'+>，且CD3<'+>與CD56<'+>均達(dá)90％以上，經(jīng)安全性檢測(cè)，臍血CIK細(xì)胞無(wú)細(xì)菌、無(wú)病毒及內(nèi)毒素污染，安全可靠。 2．臍血CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療中晚期肺癌病人：臍血CIK細(xì)胞靜脈輸注肺癌病人后，病人主觀無(wú)不良反應(yīng)，且病人免疫系統(tǒng)功能有所改善。 3．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)過(guò)繼免疫治療的肺癌病人外周血中T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的變化：經(jīng)臍血CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療肺癌病人后，肺癌病人外周血T、Th、Ts淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，且T

8、、Th淋巴細(xì)胞數(shù)增加幅度較大。但Th/Ts比值幾無(wú)變化。 4．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)過(guò)繼免疫治療的肺癌病人外周血中B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化：過(guò)繼免疫治療后，肺癌病人外周血B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞計(jì)數(shù)雖有增加，但不明顯。 5．MTT法檢測(cè)過(guò)繼免疫治療的肺癌病人外周血PBMC對(duì)K562的體外細(xì)胞毒活性：過(guò)繼免疫治療后，肺癌病人外周血PBMC對(duì)K562的體外NK殺傷活性雖然增加不顯著，但結(jié)合專業(yè)意義，其殺傷活性還是有所增加。

9、 6．MTT法檢測(cè)過(guò)繼免疫治療的肺癌病人外周血PBMC對(duì)Hepa-CEA+及Hepa-CEA-細(xì)胞的殺傷活性：在專業(yè)意義上，該病人外周血PBMC對(duì)Hepa-CEA+細(xì)胞的殺傷活性增加比對(duì)Hepa-CEA-細(xì)胞的殺傷活性增加的要多，盡管二者殺傷活性改變幅度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1．制備的臍血CIK細(xì)胞安全、可靠，可用于本試驗(yàn)中晚期肺癌患者的過(guò)繼免疫治療研究。 2．中晚期肺癌病人經(jīng)臍血CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療后

10、，其免疫功能有不同程度的改善，T、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞均有不同程度的升高，其中以T及Th淋巴細(xì)胞升高較為普遍。 3．臍血CIK細(xì)胞對(duì)中晚期肺癌病人過(guò)繼免疫治療療效的主要免疫學(xué)指標(biāo)可能為T及Th淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)變化情況。 4．臍血CIK細(xì)胞作用于腫瘤細(xì)胞是以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，而T及Th淋巴細(xì)胞增殖可能是臍血CIK細(xì)胞抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的主要環(huán)節(jié)。 5．臍血CIK細(xì)胞過(guò)繼免疫治療肺癌患者后，其外周血的單個(gè)核細(xì)胞