T細(xì)胞過繼免疫治療小鼠腦膠質(zhì)瘤原位模型的研究.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤之一，目前的主要治療手段包括手術(shù)、放療以及化療，但即使這些治療方法聯(lián)合應(yīng)用，膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后仍然較差。新興的治療方法包括免疫治療、小分子靶向藥物治療以及基因治療等，為膠質(zhì)瘤的治療提供了光明的前景。其中細(xì)胞免疫治療方法近年來不斷推陳出新，在各種生物治療中表現(xiàn)突出。1985年Rosenberg首次應(yīng)用自體淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(Lymphokine Activated Killer cells，LAK)治療黑

2、色素瘤，自此細(xì)胞免疫治療已逐步應(yīng)用于慢性白血病、腎癌以及乳腺癌等并取得一定療效。也有研究者嘗試應(yīng)用該方法治療腦膠質(zhì)瘤，但由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫的特殊性，病人的總體生存期未見明顯改善，并且腦水腫等副作用也限制了其發(fā)展。
　　近年來隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步及中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫概念的更新，腦膠質(zhì)瘤的細(xì)胞免疫治療迎來了新的機(jī)遇。其T淋巴細(xì)胞即胸腺依賴淋巴細(xì)胞，簡(jiǎn)稱T細(xì)胞。來源于骨髓多能干細(xì)胞，是重要的免疫細(xì)胞。成熟的T細(xì)胞經(jīng)血流分布至外周免疫

3、器官的胸腺依賴區(qū)定居，并可經(jīng)淋巴管、外周血和組織液等進(jìn)行再循環(huán)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，同樣發(fā)揮著重要的免疫作用。T細(xì)胞過繼免疫治療近年來不斷推陳出新。本研究探討了T細(xì)胞過繼免疫治療膠質(zhì)瘤的方法，即應(yīng)用GL261細(xì)胞混合抗原誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(Dentric Cell，DC)成熟，成熟DC體外刺激并擴(kuò)增外周T細(xì)胞，將這種T細(xì)胞回輸膠質(zhì)瘤荷瘤鼠模型來治療膠質(zhì)瘤，并用驗(yàn)證其可行性和有效性，為今后細(xì)胞過繼免疫治療臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　目的

4、:探究GL261腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞裂解物制備的抗原誘導(dǎo)的特異性T細(xì)胞對(duì)于小鼠腦膠質(zhì)瘤過繼免疫治療的可行性及有效性。
　　方法:培養(yǎng)GL261腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用反復(fù)凍融法制備GL261細(xì)胞混合抗原。在無(wú)菌環(huán)境下提取健康C57BL/6小鼠骨髓單核細(xì)胞，用鼠源性粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(mouse-derived Granulocyte-MacrophageColony-Stimulating Factor, mGM-CSF)、鼠源性白介素-4

5、(mouse-derived Interleukin-4，mIL-4)體外誘導(dǎo)，進(jìn)而獲取未成熟DC，將未成熟DC與抗原共孵育獲取成熟樹突狀細(xì)胞。在無(wú)菌條件下取出健康C57BL/6小鼠脾臟并剪碎，用胰酶消化成單細(xì)胞懸液并裂解紅細(xì)胞得到脾臟細(xì)胞懸液，用尼龍毛柱法分選脾臟細(xì)胞獲取T細(xì)胞。將成熟DC與T細(xì)胞共育獲取GL261膠質(zhì)瘤特異性T細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)獲取的膠質(zhì)瘤特異性T細(xì)胞的增殖情況并觀察膠質(zhì)瘤特異性T細(xì)胞的亞群變化，MTT法檢測(cè)膠質(zhì)瘤

6、特異性T細(xì)胞對(duì)GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外殺傷作用。
　　用ALC-H型小鼠腦立體定向儀固定小鼠頭顱，將GL261膠質(zhì)瘤單細(xì)胞懸液注入健康C57BL/6小鼠建立GL261-C57BL/6小鼠腦膠質(zhì)瘤模型，共注射16只小鼠，隨機(jī)分成治療組和對(duì)照組，每組8只。治療組用上述膠質(zhì)瘤特異性T細(xì)胞進(jìn)行尾靜脈注射免疫治療，對(duì)照組尾靜脈注射PBS。治療結(jié)束后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血中T細(xì)胞亞群變化情況，并觀察兩組的生存期。
　　結(jié)果:①C

7、57BL/6小鼠骨髓單核細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)6天后，CD11c+比例為(87±3.47)％，小鼠骨髓單核細(xì)胞可被成功誘導(dǎo)為未成熟DC。②未成熟DC與抗原共育18小時(shí)后，CD80、CD86表達(dá)增高(P＜0.05)，成功獲得了成熟DC。③用成熟DC刺激T細(xì)胞，72小時(shí)后T細(xì)胞分裂指數(shù)可達(dá)0.56±0.01，而用未成熟DC刺激T細(xì)胞72小時(shí)后T細(xì)胞分裂指數(shù)僅為0.28±0.02，表明成熟DC能顯著促進(jìn)T細(xì)胞增殖(P＜0.05)。④未成熟DC與T

8、細(xì)胞共育6天后，T細(xì)胞亞群發(fā)生變化:CD8a/CD4比值為0.63±0.06，而成熟DC組為2.03±0.06(P＜0.05)。⑤分別按效靶比為20∶1、40∶1、60∶1的濃度梯度進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)，隨著效靶比升高，T細(xì)胞對(duì)GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷率逐漸升高，當(dāng)效靶比分別為40∶1和60∶1時(shí)，成熟DC誘導(dǎo)的GL261膠質(zhì)瘤特異性T細(xì)胞殺傷率分別為（40.67±1.53）％和（62.67±2.52）％，未成熟DC組分別為(22±2.6

9、5)％和（26.33±2.08）％，成熟DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用顯著高于未成熟DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞(P＜0.05)。⑧核磁共振能夠證實(shí)膠質(zhì)瘤原位模型接種成功。⑦T細(xì)胞治療后小鼠外周血CD8a/CD4比值可達(dá)1.02±0.28，而對(duì)照組僅為0.69±0.09(P＜0.05)。⑧治療組小鼠生存期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。
　　結(jié)論:GL261細(xì)胞混合抗原致敏的成熟DC能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖并提高殺傷性T細(xì)胞的比例，膠質(zhì)瘤