特異性CTL對(duì)移植性小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤免疫治療的研究.pdf

1、目的:樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)是動(dòng)物體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞(antigenprocessing cell,APC)。在捕獲腫瘤細(xì)胞之后,DC遷移到淋巴結(jié)中將腫瘤抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)其成為具有腫瘤特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicT lymphocyte,CTL),后者能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠的脾T淋巴細(xì)胞,經(jīng)負(fù)載神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原的DC激活后,使之成為具有抗腫瘤特異性的CTL,未負(fù)載腫瘤抗原的則為非特異

2、性CTL,將特異性CTL和非特異性CTL作為對(duì)比實(shí)驗(yàn),輸入移植性小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中,通過(guò)測(cè)量腫瘤體積以及HE染色等實(shí)驗(yàn)技術(shù),研究腫瘤特異性CTL在小鼠體內(nèi)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制以及殺傷作用。
　　方法:在小鼠骨髓中分離得到細(xì)胞懸液,以rhGM-CSF、rhIL-4、和TNF-α進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),定期觀察細(xì)胞形態(tài)的變化,收集其中的部分細(xì)胞做流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)分析,確定其為可以使用的DC細(xì)胞。用神經(jīng)膠

3、質(zhì)瘤細(xì)胞凍融抗原刺激DC,使之成為DC疫苗。制備小鼠脾T細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng),并和DC疫苗共培養(yǎng),從而誘導(dǎo)產(chǎn)生具有腫瘤抗原特異性的CTL,未經(jīng)負(fù)載腫瘤抗原的DC誘導(dǎo)的CTL就是非特異性CTL。將特異性CTL和非特異性CTL分別與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng),研究其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外殺傷作用。同時(shí),小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞懸液,建成小鼠移植瘤模型,兩周后將小鼠隨機(jī)分成三組,每組6只,每5天尾靜脈注射一次:①空白對(duì)照組(每只小鼠只局部注射生理鹽水0.

4、2 mL)。②特異性CTL組(每只小鼠局部注射抗原特異性CTL5×106個(gè)/mL0.2 mL)。③非特異性CTL組(每只小鼠局部注射非特異性CTL5×106個(gè)/mL0.2mL)。每隔5天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(a)、短徑(b),根據(jù)體積(V)=πab2/6計(jì)算腫瘤的體積,并計(jì)算腫瘤抑制率,分析腫瘤的生長(zhǎng)抑制情況。30天后處死小鼠取出瘤塊組織。將腫瘤放入福爾馬林溶液中進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋切片,然后進(jìn)行病理學(xué)經(jīng)典的HE染色,并在鏡下觀察

5、對(duì)照組和CTL治療組腫瘤細(xì)胞形念的變化。彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)果:1.從DC誘導(dǎo)第2天起,可在倒置顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞體積有所增大,形態(tài)由圓形開(kāi)始變得不規(guī)則,成多形性,可見(jiàn)細(xì)刺狀胞漿突起。誘導(dǎo)之前,DC的特異性表面標(biāo)志物CD80、CD86的百分比分別為1.25±0.09和1.74±0.11,經(jīng)與rhGM-CSF、rhIL-4共同培養(yǎng),并經(jīng)rmTNF-α誘導(dǎo)后,標(biāo)志物水平明顯升高,分別為99.02±5.34和99.4

6、7±6.28,P＜0.01;2.小鼠骨髓來(lái)源的T淋巴結(jié)細(xì)胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)前,CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞所占百分比分別為63.84±3.21、26.32±2.42和30.29±3.42。經(jīng)負(fù)載腫瘤抗原的DC誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞后,在細(xì)胞因子rmIL-2的刺激培養(yǎng)下,特異性CTL組細(xì)胞的CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分比分別為72.37±2.54、27.59±1.91和68.35±2.74:經(jīng)未負(fù)載腫瘤抗原的DC誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞后,非特異

7、性CTL組細(xì)胞的CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分比分別為70.28±2.34、25.29±1.14和63.59±3.24。與DC誘導(dǎo)之前相比,誘導(dǎo)之后的T淋巴細(xì)胞中,CD3+和CD8+T細(xì)胞的含量均有明顯的升高(P＜0.01),而CD4+T細(xì)胞含量升高并不顯著(P＞0.05):3.神經(jīng)膠質(zhì)瘤移植性小鼠模型成活率100％;4.各治療組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)都有抑制作用,從第15天開(kāi)始到第30天,對(duì)照組與各治療組移植瘤體積都具有顯著性差異。特異性C

8、TL組對(duì)移植瘤生長(zhǎng)抑制最明顯,治療15天后腫瘤體積平均達(dá)70±2.94 mm3,小于非特異性CTL組(93±2.43 mm3),與空白對(duì)照組(122±5.25 mm3)相比,差異具有顯著性(P=0.000),特異性CTL組抑瘤率(72.85±4.38)％明顯高于非特異性CTL組(47.14±2.96)％抑瘤率,差異有顯著性(P＜0.05);5.移植瘤標(biāo)本進(jìn)行HE染色,鏡下證實(shí)移植瘤為神經(jīng)膠質(zhì)瘤,治療組瘤組織可見(jiàn)有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);6.彗