cDNA芯片和Oligo芯片在人腦膠質瘤特異性靶標研究中的應用.pdf

1、目的：利用臨床收集的150例左右膠質瘤標本，利用cDNA芯片和Affymetrix Oligo芯片對不同樣本在不同平臺進行膠質瘤特異性靶標篩選和分析，并對兩組芯片篩選出的12重要基因進行實時熒光定量PCR(RT-PCR)驗證，通過上述分析找到有進一步深入研究價值的診斷靶標和治療靶點。同時采用Meta分析對兩種芯片找到的數(shù)據(jù)進行整合分析，較好解決不同平臺、不同芯片、不同樣本，導致芯片分析的數(shù)據(jù)重復性和可靠性差的問題。最后，總結了應用基因芯

2、片對膠質瘤進行研究的方法。 方法： 1、cDNA芯片腦膠質瘤數(shù)據(jù)分析該部分應用cDNA芯片技術建立38張膠質瘤基因表達譜，其中星形質瘤細胞瘤Ⅰ級1例；Ⅱ級7例；Ⅲ級5例；Ⅳ級20例，少枝膠質細胞瘤Ⅱ級4例；Ⅲ級1例。結合膠質瘤臨床流行病學特點對其進行生物信息學分析，篩選在所有膠質瘤實驗組和對照組一致上調或下調的差異表達基因；篩選星形膠質瘤、室管膜瘤、少枝膠質細胞瘤之間差異基因；篩選和增殖、凋亡和分化相關的基因；并關注目前

3、研究中與膠質瘤發(fā)病和惡性變相關的熱點基因或生物學指標的變化；針對篩選出的重點差異表達基因，對其生物學功能結合當前數(shù)據(jù)庫和文獻報道，以整體和網(wǎng)絡的思想闡明其間相互作用關系，進而探討膠質瘤發(fā)病和惡變的機制。 2、Affymetrix Oligo芯片腦膠質瘤數(shù)據(jù)分析本部分使用Affymetrix Human U133 2.0基因表達譜芯片，該芯片含54000個探針集，45000個轉錄本、38500個已知功能基因對星形質瘤細胞瘤Ⅰ級2例

4、；Ⅱ級5例；Ⅲ級5例；Ⅳ級5例，少枝膠質細胞瘤Ⅱ級5例；室管膜瘤Ⅱ級4例共26例膠質瘤進行表達譜分析。應用生物信息學及相應軟件對數(shù)據(jù)進行Gene Ontology和GO分析；利用挖掘出的基因數(shù)據(jù)利用支持向量機法和貝葉斯混合協(xié)變量分析法對高、低級別膠質瘤進行判別檢驗；挖掘出的基因數(shù)據(jù)利用最近鄰域分析法和最近質心法對三種不同類型膠質瘤進行判別檢驗；并用貝葉斯學習構建基因相互作用網(wǎng)絡。 3、對兩組芯片篩選出的12條重要基因進行實時熒光

5、定量PCR(RT-PCR)驗證4、對cDNA芯片和Oligo芯片腦膠質瘤表達譜數(shù)據(jù)Meta分析并總結應用基因芯片對膠質瘤進行研究的方法 結果： 1、篩選出的差異基因： (1)按不同標準篩選出不同類型膠質瘤及不同級別膠質瘤之間差異基因①、13例星形膠質瘤(A)、20例膠質母細胞瘤(G)、5例少枝膠質瘤(O)之間以p(0.1為標準篩選出111條差異基因，功能涉及細胞周期、有絲分裂、細胞免疫等重要功能； ②、低

6、級別星膠(AⅠ+AⅡ)9例與高級別星膠(AⅢ+GBM)之間以p(0.01為標準篩選出409條差異基因； ③、A與G之間p<0.005為標準篩選出145條差異基因； ④、A與O之間p<0.01為標準篩選出391條差異基因； ⑤、G與O之間p<0.005為標準篩選出452條差異基因，用以上差異基因進行非監(jiān)督聚類，均能理想?yún)^(qū)分不同腫瘤，證實不同級別及類型膠質瘤間存在基因上的不同； (2)對AⅡ7例、AⅢ5例、G

7、BM 20例進行差異基因篩選： ①、AⅡ與AⅢ以p<0.01篩選出78條差異基因； ②、AⅢ與GBM以p<0.005篩選出66條差異基因；低級別星膠(AⅠ+AⅡ)9例與高級別星膠(AⅢ+GBM)之間以p<0.01為標準篩選出409條差異基因； ③、AⅡ與GBM以p<0.001篩選出121條差異基因，聚類結果理想。 2、依據(jù)cDNA膠質瘤表達譜芯片數(shù)據(jù)結合統(tǒng)計學方法建立判別方程，對膠質瘤樣本進行預測和判斷。

8、 膠質瘤在顯微鏡下病理診斷存在主觀誤差，鑒于膠質瘤基因表達譜的樣本聚類結果提示其病理分類有分子生物學基礎，本實驗依據(jù)cDNA膠質瘤表達譜芯片數(shù)據(jù)結合統(tǒng)計學方法嘗試建立判別方程，可以對膠質瘤樣本較好的預測和判斷。 3、研究中所發(fā)現(xiàn)的差異表達的基因、重要染色體以及在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用通路在所有38例樣本中，其中至少在27例(70％)膠質瘤中都有差異表達的基因677條。其中一致下調的基因有453個，一致上調的基因有22

9、4個。其中屬于intracellularcomponent、binding和metabolism組分的較多，其功能主要包括調節(jié)細胞增殖、細胞周期、及細胞分化等。對與膠質瘤相關的差異表達基因進行了染色體定位研究，發(fā)現(xiàn)膠質瘤的染色體變化多涉及1p，17p,13q,9p，19,10,22q,18q,和7,12q，和相關文獻報道一致。在調控通路方面進行生物信息分析，發(fā)現(xiàn)如下通路在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用：cell cycle；cell dif

10、ferentiate-on；apotosis；immune respone；DNA repair；cell proliferation。在對膠質瘤發(fā)生發(fā)展相關重點基因分析中發(fā)現(xiàn)有10條重要上調基因值得深入研究。 4、星形膠質瘤中腫瘤標志物研究對33張星形膠質瘤芯片進行重點分析，目的找到能做為鑒別星形膠質瘤及不同惡性程度的腫瘤標志物，按在1/3星膠中及1.5倍表達差異為標準，T檢驗、FDR雙重統(tǒng)計學方法篩選出星形膠質瘤Ⅰ、Ⅱ級與Ⅲ

11、、Ⅳ級間分型基因148條，上調34條，下調114條；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級與Ⅳ級星膠分型基因110條，上調28條，下調82條。為找到理想診斷靶和治療靶做進一步深入研究，特別關注以下幾條隨星形膠質瘤級別增加而表達增加的上調基因。 ① COL1A2； ② MAP3K7； ③ SGCE； ④ RB1； ⑤ CCL4； ⑥ SPP1； ⑦ ID3； ⑧ MTHFD1： ⑨ NPC2；

12、 ⑩ GMEB1。 5、星形膠質瘤Ⅱ級、少枝膠質瘤Ⅱ級、室管膜瘤Ⅱ級三種同一級別不同類型膠質瘤的分子標志物研究。 所分析出的這些基因可較準確地區(qū)分和預測以上三類腫瘤。支持向量機法和貝葉斯混合協(xié)變量分析法能較好對高、低級別膠質瘤進行判別檢驗，準確率在85％以上；挖掘出的基因數(shù)據(jù)利用最近鄰域分析法和最近質心法對三種不同類型膠質瘤進行判別檢驗的準確率不到70％；并用貝葉斯學習構建基因相互作用網(wǎng)絡，能較好說明10條重要基

13、因相互之間作用關系。 6、VEGF、SOD2、COL1A2、MAP3K7、CDC2、SPP16條基因經(jīng)RT-PCR驗證，與星形膠質瘤病理級別呈正向依賴關系。 結論： 1、基因芯片技術在后基因組時代在膠質瘤研究中仍發(fā)揮重要作用； 2、不同平臺、不同芯片、不同樣本，芯片分析的數(shù)據(jù)不盡相同，而Meta分析能較好解決芯片數(shù)據(jù)的重復性和可靠性差的問題； 3、生物信息學能很好對芯片數(shù)據(jù)進行挖掘和分析；