過(guò)敏原特異性IgE檢測(cè)芯片的研制及初步應(yīng)用.pdf

1、Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)是一種IgE水平異常增高的疾病狀態(tài)，涉及兒科、內(nèi)科、耳鼻喉科和皮膚科等多個(gè)學(xué)科，嚴(yán)重者可以引起過(guò)敏性休克甚至死亡。世界上大約有1/4的人飽受I型變態(tài)反應(yīng)困擾。近幾年，隨著生活環(huán)境和生活方式的改變，新的變應(yīng)原不斷出現(xiàn)，發(fā)病率日漸增多。過(guò)敏原的檢測(cè)可以在早期識(shí)別敏感病人，決定后續(xù)預(yù)防與治療措施。目前對(duì)過(guò)敏原的體外檢測(cè)方法(FAST、ELISA)操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，每次只能檢測(cè)一種或者少數(shù)幾種過(guò)敏原，而作為常規(guī)檢測(cè)的過(guò)敏原有200余種

2、，這給臨床醫(yī)生在選擇檢測(cè)項(xiàng)目和具體操作時(shí)帶來(lái)困難。 目的：研制一種可同時(shí)檢測(cè)18種過(guò)敏原特異性IgE的蛋白質(zhì)芯片，并初步應(yīng)用于臨床檢測(cè)，為將來(lái)給臨床提供一種高效實(shí)用的過(guò)敏原特異性IgE檢測(cè)技術(shù)與方法奠定基礎(chǔ)。 方法：1.過(guò)敏原提取液原液的蛋白濃度測(cè)定與濃縮處理；2.以多聚賴(lài)氨酸處理玻片、甲醇處理PVDF膜片、PBS處理硝酸纖維素膜片和尼龍膜片為固相載體，制備不同基片的芯片，對(duì)海魚(yú)特異性IgE陽(yáng)性的同一標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢

3、測(cè)結(jié)果優(yōu)選固相基片；3.分別以戊二醛、乙醇和丙酮作為化學(xué)藥物交聯(lián)劑，對(duì)過(guò)敏原點(diǎn)樣后的固定條件進(jìn)行優(yōu)化；4.用L16(44×23)正交法對(duì)芯片制備及使用條件進(jìn)行優(yōu)化。Scanarray4000激光共聚掃描儀成像，Quantarray軟件分析熒光強(qiáng)度；5.根據(jù)上述結(jié)果制備可同時(shí)檢測(cè)18種過(guò)敏原的蛋白質(zhì)芯片并對(duì)芯片的檢測(cè)靈敏性、重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)；6.本芯片和IVT試劑盒對(duì)138份標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

4、 結(jié)果：選擇硝酸纖維素膜為固相基片，制備條件與過(guò)程為：1)配制過(guò)敏原點(diǎn)樣液；2)點(diǎn)樣后37℃濕盒中固定2h；3)0.1％戊二醛室溫下化學(xué)固定0.5h；4)洗膜；5)2％BSA37℃濕盒中封閉2h。 使用條件及步驟：1)1：8稀釋待檢血清后與芯片37℃濕盒中雜交2h；2)洗膜；3)加2.5μg/mL生物素37℃濕盒中孵育1h；4)1.25μg/mL親和素37℃濕盒中孵育1h；5)洗膜、干燥后掃描。 芯片的檢測(cè)靈敏性、重復(fù)

5、性、穩(wěn)定性好，血清稀釋128倍仍可檢測(cè)到特異性IgE的存在。與IVT試劑盒進(jìn)行比較，兩種方法對(duì)雞蛋、海魚(yú)、大豆、花生、大籽蒿花粉等大部分過(guò)敏原的檢出率無(wú)差異(x2檢驗(yàn)p＞0.05)，陽(yáng)性檢測(cè)符合率為60.19％。 結(jié)論：過(guò)敏原特異性IgE檢測(cè)芯片，將目前對(duì)過(guò)敏原特異性IgE的單一檢測(cè)(或少數(shù)幾種的檢測(cè))變?yōu)槎喾N同時(shí)檢測(cè)，具有樣本用量少、檢測(cè)指標(biāo)多、操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。這是國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)多種過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)。該方