海產(chǎn)品過敏原免疫芯片檢測方法的研究.pdf

1、海產(chǎn)品及其制品是聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的主要過敏原之一，海產(chǎn)品過敏問題越來越受到人們廣泛的關(guān)注。由于極微量的過敏原就能導(dǎo)致嚴重的過敏反應(yīng)，探索有效的海產(chǎn)品過敏原檢測方法，有助于提高海產(chǎn)品的食用安全性。 本論文以主要海產(chǎn)品過敏原為研究對象，選擇南美白對蝦(Penaeus Vannamei)、雜色蛤(Ruditapes philippinarum)、鲅魚(Scomberomorus niphonius)等常見水產(chǎn)品為代表，進行過敏原的提

2、取及純化，采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)建立了過敏原檢測的技術(shù)體系。主要從南美白對蝦、雜色蛤、鲅魚等主要過敏原的分離純化、抗體制備、三維蛋白芯片制備、過敏原檢測生物探針的制備、芯片檢測條件的優(yōu)化等方面進行研究，得到如下結(jié)論： 1.優(yōu)化了硫酸銨沉淀法分離純化過敏原的方法，通過向一定濃度、pH值的硫酸銨溶液中加入海產(chǎn)品粗提蛋白的方式，提高硫酸銨沉淀過敏原的準確性，并通過電泳切膠回收得到純度為95％以上的海產(chǎn)品過敏原蛋白。 2.確定并優(yōu)化

3、了三維蛋白質(zhì)芯片的制備條件。分別采用原子力顯微鏡和X-射線光電子能譜對修飾后的芯片表面進行物理和化學(xué)表征，結(jié)果表明使用3％氨基硅烷修飾玻片、0.1mol/mL NaIO4活化瓊脂糖芯片表面能夠形成均勻的三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，表面衍生的活性醛基有助于改善親水性能及形成三維化凝膠表面，提高生物分子的固定效果。 3.利用純化后的南美白對蝦、雜色蛤、鲅魚主要過敏原蛋白免疫新西蘭大白兔獲得了高效價的多克隆抗體，三種海產(chǎn)品過敏原蛋白抗血清的效價分別

4、為1.5×106、2.0×106和1.0×106。獲得南美白對蝦、雜色蛤、鲅魚的鼠源單克隆抗體，共得到9株單克隆抗體。經(jīng)過亞型的鑒定，本研究發(fā)現(xiàn)鲅魚單抗的3株單克隆抗體均為IgG1類型，而雜色蛤的3株單克隆抗體中，只有一株為IgG1類型，另外兩株分別為IgA和IgM類型，南美白對蝦的2株單克隆抗體均為IgG1類型。對獲得的單克隆抗體進行生物素標記，制備了靈敏的海產(chǎn)品過敏原檢測探針。 4.通過響應(yīng)面的方法分別確定了蛋白芯片法檢測南

5、美白對蝦、雜色蛤、鲅魚等三種過敏原的最佳反應(yīng)條件。確定南美白對蝦過敏原檢測限為20ng/mL，線性檢測范圍為20.0ng/mL～20.Oμg/mL；雜色蛤過敏原檢測限為40ng/mL，線性檢測范圍為40.0ng/mL～40.0μg/mL。鲅魚過敏原檢測限為20ng/mL，線性檢測范圍為20.0ng/mL～20.0μg/mL。 5.測定海產(chǎn)品過敏原檢測芯片性能，結(jié)果表明批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV％)均在5％-10％之間。不同過敏原檢

6、測系統(tǒng)之間不發(fā)生交叉反應(yīng)。南美白對蝦、鲅魚、雜色蛤三種過敏原在饅頭中的平均回收率都在75％左右：而鲅魚和南美白對蝦過敏原在牛奶中的回收率達到90％以上，雜色蛤過敏原在牛奶中的回收率略低，也達到80％以上。 目前針對海產(chǎn)品過敏原檢測的方法主要集中在酶聯(lián)免疫等傳統(tǒng)的檢測方法上，采用免疫芯片對海產(chǎn)品過敏原進行檢測的方法尚未見報道。本研究結(jié)合過敏原檢測的特點，首次對三維芯片載體的基片進行處理，得到了具有良好固定效果的三維芯片載體，并在此