基于點(diǎn)印跡的水產(chǎn)品過(guò)敏原檢驗(yàn)方法的研究.pdf

1、食品過(guò)敏已引起了全球多個(gè)國(guó)際組織和國(guó)家的高度重視，但食物過(guò)敏原的診斷仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的安全性問(wèn)題，體外實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)食物過(guò)敏原正受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前已有很多體外過(guò)敏原特異性IgE檢測(cè)設(shè)備及試劑盒被廣泛應(yīng)用，以Immuno CAP為代表的檢測(cè)儀器準(zhǔn)確率高但設(shè)備費(fèi)用昂貴，普及率低。此外，食物過(guò)敏原由于地域性差異其種類也有很大的區(qū)別，現(xiàn)有的檢驗(yàn)試劑盒多為進(jìn)口，過(guò)敏原組合不符合中國(guó)國(guó)情、結(jié)果準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性較差。本研究立足上述問(wèn)題，旨在研

2、究出一種結(jié)果準(zhǔn)確、適用于我國(guó)過(guò)敏人群、操作簡(jiǎn)便快捷、成本較低的食物過(guò)敏原檢驗(yàn)方法。
　　 本論文以我國(guó)過(guò)敏人群主要食物過(guò)敏原魚類為研究對(duì)象，通過(guò)過(guò)敏原鑒定、交叉反應(yīng)研究及加工對(duì)過(guò)敏原免疫活性的影響的研究探討用以檢驗(yàn)的過(guò)敏原的選擇條件；建立了基于點(diǎn)印跡檢驗(yàn)方法的肉眼可視化食物過(guò)敏原檢驗(yàn)方法并進(jìn)行了性能測(cè)定，最后通過(guò)與其他檢驗(yàn)方法的結(jié)果比對(duì)驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。主要內(nèi)容如下：
　　 1、對(duì)青島地區(qū)常見(jiàn)的7個(gè)魚類品種進(jìn)行了過(guò)敏原鑒定，

3、發(fā)現(xiàn)真鯛、阿拉斯加狹鱈、鯉魚、鮭魚、藍(lán)點(diǎn)馬鮫、大菱鲆及大黃花魚等的過(guò)敏原蛋白分子量為35～42kD、48～51kD、28～30kD及17kD，其中主要過(guò)敏原為41kD蛋白，并非國(guó)際公認(rèn)的小清蛋白；7種魚過(guò)敏原蛋白之間存在著嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，故可選擇其中一種作為魚肉過(guò)敏原代表進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果基本可表示魚類過(guò)敏原總體情況。
　　 2、研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)熱加工后，大菱鲆魚肉蛋白組分中分子量較大的蛋白有很大程度的降解，免疫活性基本喪失；熱加工

4、使魚肉過(guò)敏原蛋白的免疫活性降低，蒸5min后免疫活性降低67.9％，蒸30min后減少了89.2％的免疫活性：而魚肉中小清蛋白及其免疫活性并未隨著加熱發(fā)生明顯改變，耐熱性好。而加熱后，魚肉蛋白中產(chǎn)生了一條新的具有致敏性的蛋白，分子量～18kD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱加工對(duì)的魚肉過(guò)敏原的免疫活性有較大的改變，對(duì)生鮮魚肉產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)不一定會(huì)對(duì)加工后的魚肉產(chǎn)生相同反應(yīng)，反之亦然。這對(duì)過(guò)敏原的檢驗(yàn)方法的研究具有一定的指導(dǎo)意義，即：過(guò)敏原的檢驗(yàn)中有必要

5、將生鮮食物與經(jīng)過(guò)不同加工方式的食物過(guò)敏原進(jìn)行細(xì)分，從而得到更加準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果，也可為過(guò)敏患者提供一定的食用指導(dǎo)。
　　 3、采用硝酸纖維素膜作為水產(chǎn)品過(guò)敏原載體，建立了肉眼可視化點(diǎn)印跡檢驗(yàn)水產(chǎn)品過(guò)敏原的方法，即：過(guò)敏原蛋白點(diǎn)樣濃度為1mg/mL，人血清用50％封閉液稀釋10倍，于37℃孵育1h，二抗采用1:1000倍稀釋的HRP-羊抗人IgE，于37℃孵育45min，顯色液采用沉淀型TMB顯色液避光顯色15min，且過(guò)敏反應(yīng)程度

6、與點(diǎn)灰度值正相關(guān)。檢驗(yàn)方法性能測(cè)定結(jié)果表明，硝酸纖維素膜內(nèi)變異系數(shù)為1.9％～6.7％，膜間變異系數(shù)在3.3％～8.9％之間，穩(wěn)定性良好。
　　 4、通過(guò)與皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比對(duì)表明，三種方法結(jié)果無(wú)顯著性差異。其中，肉眼可視化點(diǎn)印跡檢驗(yàn)的結(jié)果與免疫印跡結(jié)果一致性為82％、與皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)結(jié)果一致性為62％。此外，肉眼可視化點(diǎn)印跡檢驗(yàn)方法與一種商業(yè)化的食物過(guò)敏原檢驗(yàn)試劑盒相比，檢驗(yàn)結(jié)果與免疫印跡和皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)結(jié)果更加接