章魚新型過敏原研究.pdf

1、隨著人民生活水平的提高，水產(chǎn)食品的消費(fèi)量增長(zhǎng)也同時(shí)帶來了水產(chǎn)食物過敏的問題。作為水產(chǎn)食物中軟體頭足類的主要產(chǎn)品種類，章魚所引發(fā)的食物過敏病例也時(shí)有出現(xiàn)。因此，對(duì)于章魚過敏原以及消減技術(shù)的研究具有非常重要的價(jià)值。本研究以真蛸為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在以往研究的基礎(chǔ)上鑒別新型過敏原，并對(duì)其理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)和抗原表位進(jìn)行分析，同時(shí)探索新型加工技術(shù)對(duì)過敏原的影響及消減作用，以期為過敏性疾病的診斷和治療，以及低致敏性食品的開發(fā)提供理論支持。
　　通過

2、軟體類過敏患者陽(yáng)性血清進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)章魚肌漿蛋白中有分子量為28 kDa的新型過敏組分，通過硫酸銨鹽析、連續(xù)柱層析(Q-Sepharose、Sephacryl S-200)方法分離純化獲得目的蛋白，經(jīng)過 MALDI-TOF-MS鑒定，確定其為章魚中的磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase，TIM)。通過免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，并采用親和柱層析純化得到兔抗章魚TIM-IgG。經(jīng)分析得到，其分子量為28

3、kDa。該蛋白等電點(diǎn)約為7.6，總糖含量為1.7％。克隆得到cDNA全長(zhǎng)為1140 bp，ORF長(zhǎng)度為744 bp，編碼247個(gè)氨基酸，理論分子量為26.27 kDa，理論等電點(diǎn)為7.76。蛋白三維結(jié)構(gòu)為典型的(β/α)8-barrel結(jié)構(gòu)。TIM受熱不穩(wěn)定，在45°C以上會(huì)發(fā)生聚合，聚合后的產(chǎn)物仍具有IgG結(jié)合活性，IgE結(jié)合活性隨溫度升高略有下降，二級(jí)結(jié)構(gòu)展開成無序狀態(tài)。極端酸堿環(huán)境下TIM蛋白分子較穩(wěn)定，其IgG結(jié)合活性不受影響，

4、但在pH<4.0和pH>9.0時(shí)IgE結(jié)合活性降低，酸性環(huán)境下二級(jí)結(jié)構(gòu)變化較大。TIM對(duì)模擬胃液消化較敏感，消化后產(chǎn)物仍具有IgE結(jié)合活性，對(duì)模擬腸液消化耐受。采用生物信息學(xué)模擬得到8個(gè)線性表位 L-TIM-1(N14G15N16K17K18S19), L-TIM-2(N33A34D35), L-TIM-3(R51S52K53L54), L-TIM-4(S95E96R97R98), L-TIM-5(K129L130E131E132R13

5、3E134A135G136K137T138), L-TIM-6(H152T153K154D155W156), L-TIM-7(N194A195S196), L-TIM-8(L219G220Q221K222P223D224)，通過噬菌體展示技術(shù)得到1個(gè)構(gòu)象型表位C-TIM(A71G74S69D75T73F72V67)。發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的不同物種中的TIM具有較高相似度，所得到的抗原表位多數(shù)位于保守區(qū)域。
　　在以往研究基礎(chǔ)之上，將傳統(tǒng)的美

6、拉德反應(yīng)和高溫高壓加工進(jìn)行結(jié)合，開發(fā)出了一種低致敏性熟制章魚產(chǎn)品的加工方法，檢測(cè)加工后產(chǎn)品中的過敏原，發(fā)現(xiàn)其致敏性顯著降低。超高壓處理對(duì)于章魚中主要過敏原的致敏性也具有效果，通過分析章魚肌漿蛋白中重要過敏原AK在超高壓處理后的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)在500 MPa壓力下處理20 min后，過敏原分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，隨機(jī)結(jié)構(gòu)(β-轉(zhuǎn)角+無規(guī)則卷曲)增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)趨向于無序化，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變得更加松散；游離巰基含量降低了80%，以二硫鍵形