桃過(guò)敏原表達(dá)鑒定和免疫分析.pdf

1、桃(Prunus persicaL.Batsch)是我國(guó)水果過(guò)敏中較為常見(jiàn)的種類。國(guó)外已鑒定四類桃過(guò)敏原(Prup1-Prup4)。但對(duì)于我國(guó)患者來(lái)講，究竟是由哪種主要蛋白引發(fā)過(guò)敏缺乏深入的研究。本文主要研究桃過(guò)敏原提取物的制備方法，桃過(guò)敏原組分的單克隆抗體生產(chǎn)，相關(guān)基因在果實(shí)中表達(dá)差異，重組蛋白的理化和免疫活性鑒定以及桃過(guò)敏臨床病例的血清免疫鑒定。分析了桃四類候選過(guò)敏基因家族成員在不同組織間的表達(dá)模式差異，鑒別主要表達(dá)成員，比較不同桃

2、品種果實(shí)中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)量，與桃基因組序列中相關(guān)過(guò)敏基因數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。開(kāi)展桃Prup1三個(gè)不同成員的載體構(gòu)建、大腸桿菌體外表達(dá)和純化，鑒定純化產(chǎn)物的理化性質(zhì)、生理功能和免疫活性差異。首次收集中國(guó)桃過(guò)敏患者血清，分析患者主要過(guò)敏原組分和地區(qū)間差異，明確我國(guó)桃果實(shí)主要過(guò)敏原。主要結(jié)果如下:
　　 1、比較了四種緩沖液提取桃果皮總蛋白粗提物的效果，確定了Coca's緩沖液適宜于桃蛋白粗提取物制備。該方法獲得的產(chǎn)物在桃過(guò)敏

3、患者體內(nèi)進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)(SPT)，初步確認(rèn)其免疫活性。免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了桃主要過(guò)敏蛋白分子量為9kDa。以重組脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(LTP, Prup3)為免疫原，成功制備鼠單克隆抗體，為桃提取物的標(biāo)準(zhǔn)化以及研究LTP在果實(shí)生長(zhǎng)和發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 2、在轉(zhuǎn)錄水平確認(rèn)了在果實(shí)中表達(dá)的7個(gè)關(guān)鍵過(guò)敏基因成員，包括Prup1.01，Prup1.06B，Prup2.01A，Prup2.01B，Prup3.01，Prup4.01和Pr

4、up4.02。部分成員具有組織特異性，其中Prup1.02僅在幼葉中表達(dá)，果肉中基本無(wú)Prup3.01成員表達(dá)，并且Prup3.02和Prup3.03僅分別在幼葉和花藥中表達(dá)。在11個(gè)桃品種中，Prup1和Prup2兩個(gè)過(guò)敏基因家族的關(guān)鍵成員表達(dá)差異較大，而Prup3和Prup4差異較小。在桃基因組序列中新發(fā)現(xiàn)8個(gè)同源基因。Prup1、Prup2和Prup3家族的部分成員以基因簇的形式分布，物理距離分別為80Kb、1.57Mb和20Kb

5、。
　　 3、成功應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)從上清中純化到3個(gè)Prup1成員(Prup1.01，Prup1.02和Prup1.06B)，從包涵體內(nèi)純化到1個(gè)成員(Prup1.03)。分子量質(zhì)譜和MALDI-TOF/TOF肽段匹配實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了蛋白序列的正確性，圓二色譜顯示正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)和微小差異。在pH3時(shí)三個(gè)成員RNA水解活性喪失，pH5時(shí)僅Prup1.06B表現(xiàn)活性,玉米素可延緩Prup1.01水解活性。3例Prup1陽(yáng)性血清的IgE

6、結(jié)合和抑制實(shí)驗(yàn)表明，Prup1.06B的免疫活性強(qiáng)于Prup1.01，為新發(fā)現(xiàn)的同源異構(gòu)過(guò)敏原。重組過(guò)敏蛋白可以進(jìn)一步研究應(yīng)用于診斷制劑產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。
　　 4、本研究共收集39例桃過(guò)敏患者血清，利用國(guó)際醫(yī)學(xué)界認(rèn)可的ImmunoCAP測(cè)定血清中結(jié)合Prup1、Prup3和Prup4的特異免疫球蛋白E(sIgE)含量，結(jié)果表明脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Prup3)為中國(guó)桃過(guò)敏患者主要過(guò)敏原。南方以單獨(dú)桃過(guò)敏為主，北方以蒿草花粉過(guò)敏伴發(fā)桃過(guò)敏為主。