中華絨螯蟹重要過敏原——血藍(lán)蛋白的抗原表位分析、重組表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的：
　　蟹體內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)，每種蛋白質(zhì)均可能成為過敏原；同時(shí)，前期結(jié)果已證實(shí)，不同蟹過敏患者之間的過敏原組分具有明顯的異質(zhì)性。因此，單組分分析逐漸成為制備用于蟹過敏患者體外診斷和個(gè)體化治療的標(biāo)準(zhǔn)化抗原的基礎(chǔ)。本研究希望找到蟹中未引起重視的過敏原，證實(shí)該過敏原在中華絨螯蟹過敏中起重要作用；同時(shí)，從分析過敏原的主要抗原表位入手，構(gòu)建關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體并評(píng)估其免疫活性，探討用該重組蛋白代替天然蛋白用于中華絨螯蟹過敏患者體外診斷和個(gè)

2、體化治療的可能。
　　方法：
　　1.血藍(lán)蛋白是中華絨螯蟹中一種重要的高分子量過敏原：采用裂解液法提取獲得中華絨螯蟹總蛋白，通過SDS-PAGE、二維（2-D）電泳及Western blot技術(shù)分析蛋白提取液中的過敏原組分，再通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定蟹中未知的過敏原。以臨床蟹過敏患者的血清sIgE作為識(shí)別抗體，通過斑點(diǎn)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測疑似蛋白的反應(yīng)頻率，證明該疑似蛋白是中華絨螯蟹中一種重要的高分子量過敏原。
　　2.血藍(lán)蛋白抗

3、原表位分析及關(guān)鍵抗原表位篩選：通過三種線性抗原表位預(yù)測軟件（DNAstar Protean system, ABCpred和Bepipred Antibody Epitope Prediction）分析血藍(lán)蛋白中可能的抗原表位，篩選有重疊的肽段作為候選抗原表位，然后采用斑點(diǎn)印跡的方法，以14例蟹過敏患者血清作為一抗，分析候選抗原表位的反應(yīng)頻率，并篩選反應(yīng)頻率最高的三段抗原表位作為關(guān)鍵抗原表位。
　　3.關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體的構(gòu)建及免

4、疫學(xué)活性鑒定：將編碼關(guān)鍵抗原表位的DNA序列進(jìn)行串聯(lián)，并構(gòu)建到pET-28a質(zhì)粒中，然后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行目的蛋白的異源表達(dá)，之后利用鎳柱純化獲得目的重組蛋白。同時(shí)，重組表達(dá)中華絨螯蟹的全長血藍(lán)蛋白，用于關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體的免疫學(xué)活性鑒定。最后，采用SDS-PAGE、Western Blot鑒定目的重組蛋白，并通過ELISA、斑點(diǎn)抑制實(shí)驗(yàn)及ELISA抑制試驗(yàn)評(píng)估目的重組蛋白的免疫學(xué)活性。
　　結(jié)果：<

5、br>　　1.血藍(lán)蛋白是中華絨螯蟹中一種重要的高分子量過敏原：通過SDS-PAGE及2-D電泳的結(jié)果分析，證明本實(shí)驗(yàn)所提取的中華絨螯蟹總蛋白組分完整。Western blot結(jié)果顯示，中華絨螯蟹總蛋白提取液中至少有18種能與陽性血清反應(yīng)的蛋白組分。其中，分子量為70~80 kDa之間的兩個(gè)蛋白處于同一等電點(diǎn)，可能為同一種蛋白質(zhì)，且均能與陽性患者血清反應(yīng)，是中華絨螯蟹中的過敏組分。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示兩個(gè)疑似蛋白均為中華絨螯蟹的血藍(lán)蛋白。斑點(diǎn)

6、免疫印跡結(jié)果顯示血藍(lán)蛋白與過敏患者血清的反應(yīng)頻率為61％，證明血藍(lán)蛋白是中華絨螯蟹中一種重要的高分子量過敏原。
　　2.血藍(lán)蛋白抗原表位分析：利用抗原表位預(yù)測軟件篩選獲得10條候選抗原表位。在斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)中，所篩選的10條候選表位肽段均能與至少一例陽性血清反應(yīng)。我們將各候選表位與sIgE的反應(yīng)頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，只有表位E1、E2和E4的反應(yīng)頻率大于40%，我們篩選1、2、4號(hào)抗原表位作為關(guān)鍵抗原表位。
　　3.關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)體

7、的構(gòu)建及免疫學(xué)活性鑒定：將篩選獲得的3個(gè)關(guān)鍵抗原表位串聯(lián)表達(dá)及純化后，獲得的目的重組蛋白分子量約為12 kDa，可以良好的區(qū)分過敏血清及非過敏血清（P＜0.001），并且能夠明顯抑制全長血藍(lán)蛋白與過敏血清之間的反應(yīng)，抑制率在26~63%之間，均值為50%，劑量-反應(yīng)曲線呈S型，當(dāng)抑制劑rHc濃度為500μg/ml時(shí)，抑制率可達(dá)到93%。
　　結(jié)論：
　　1.血藍(lán)蛋白是中華絨螯蟹中重要過敏原之一，具有較強(qiáng)的致敏活性；