中華絨螯蟹卵巢組織過敏原——卵巢發(fā)展蛋白EJO1(Eris2)的重組表達及鑒定.pdf

1、目的：
　　蟹是常見的容易引起食物過敏的甲殼類動物之一。目前，大部分對蟹過敏原的研究主要集中于肌肉組織，尚未見有關(guān)蟹卵巢組織過敏原研究的相關(guān)報道。本研究的目的是期望以中華絨螯蟹為研究對象，評估蟹卵巢組織作為潛在的過敏原來源的可能性，并分析其中的過敏原組分；對于新發(fā)現(xiàn)的一種過敏原進行重組表達并評估其免疫活性和生物活性。
　　方法：
　　中華絨螯蟹卵巢組織過敏原組分分析：采用裂解液提取法分別獲得卵巢、肌肉組織的蛋白提取液，

2、經(jīng)SDS-PAGE分析卵巢、肌肉組織提取液成分的完整性，并采用Dot blotting比較二者與蟹過敏患者血清反應(yīng)性；以蟹過敏患者血清中的sIgE作為識別抗體，通過免疫印跡和2DE免疫印跡分析蟹卵巢組織提取液中的主要過敏原組分，并用MS/MS質(zhì)譜技術(shù)鑒定主要過敏原蛋白成分，證實蟹卵巢組織作為潛在的過敏原來源的可能性。
　　中華絨螯蟹卵巢主要致敏蛋白——卵巢發(fā)展蛋白EJO1（Eri s2）的重組表達及鑒定：首先，用Trizol法提取

3、中華絨螯蟹卵巢組織總RNA，擴增獲得Eri s2基因片段，并連接pET-28b(+)質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒；其次，使用Rosetta(DE3)菌株將重組質(zhì)粒進行重組表達，利用鎳柱對目的蛋白進行純化，獲得rEri s2蛋白；再次，通過 ELISA、抑制 ELISA、免疫印跡抑制試驗、嗜堿性粒細胞激活試驗等，驗證rEri s2與血清sIgE的反應(yīng)性及其活化致敏嗜堿性粒細胞的能力，初步證實rEri s2可作為已知抗原用于蟹過敏的體外診斷。
　

4、　結(jié)果：
　　中華絨螯蟹卵巢組織過敏原組分分析：SDS-PAGE結(jié)果證實裂解液提取法提取的卵巢和肌肉組織提取液蛋白成分完整。Dot blotting顯示，患者血清中的sIgE對蟹卵巢組織和蟹肌肉組織提取液的反應(yīng)性不同。免疫印跡、2DE免疫印跡發(fā)現(xiàn)，分子量（molecular weight，MW）105 kDa、pI7.5，MW85 kDa、pI8， MW70 kDa、pI5.5，MW28 kDa、pI6，MW28 kDa、pI6.

5、2處的蛋白為蟹卵巢組織中能與蟹過敏患者血清反應(yīng)的高發(fā)斑點區(qū)，經(jīng)MS/MS質(zhì)譜技術(shù)鑒定，確定卵黃蛋白原、血藍蛋白、卵巢發(fā)展蛋白EJO1、卵巢發(fā)展蛋白EJO2為中華絨螯蟹卵巢主要過敏原。
　　Eri s2的重組表達及鑒定：本研究構(gòu)建并重組表達獲得相對分子質(zhì)量約為32000的rEri s2蛋白。以rEri s2為包被抗原的ELISA結(jié)果顯示，rEri s2與29例蟹過敏患者陽性血清的反應(yīng)性明顯高于6例陰性血清（P<0.05）；抑制ELI

6、SA和免疫印跡抑制試驗結(jié)果證實，rEri s2可以抑制蟹卵巢組織提取液與蟹過敏患者血清之間的反應(yīng)；嗜堿性粒細胞激活試驗證實rEri s2可激活蟹過敏患者外周血中的嗜堿性粒細胞脫顆粒，從而證明rEri s2可作為一種重組蛋白用于蟹過敏原的檢測。
　　結(jié)論：
　　本研究結(jié)果證實蟹卵巢組織含有多種過敏原組分，至少包括卵黃蛋白原、血藍蛋白、卵巢發(fā)展蛋白EJO1（Eri s2）和卵巢發(fā)展蛋白EJO2。重組Eri s2蛋白，與sIgE具