中華絨螯蟹Sox21b基因及Dmrt2基因的克隆及組織表達分析.pdf

1、由于大部分蝦蟹類的染色體數(shù)目多且呈點狀，應用細胞遺傳學方法研究蝦蟹類性別決定非常困難，至今相關的性別決定機制尚不清楚。本文根據人的睪丸決定基因(SRY)和Dmrt基因的保守區(qū)設計簡并引物，結合RACE技術獲得Sox21b基因的全長序列和Dmrt2保守區(qū)片段，組織表達檢測結果表明Sox21b和Dmn2只在性腺中表達，暗示它們可能在性腺發(fā)育與性別分化中起著重要作用，這兩個在性腺中特異表達基因的克隆為今后從分子水平上研究中華絨螯蟹的性別分化過

2、程提供重要分子標記。 1.Sox21b基因克隆與組織表達分析 參照人SRY基因HMG-box保守區(qū)的序列設計一對簡并引物，以雌、雄中華絨螯蟹基因組DNA為模板進行簡并引物PCR擴增，結果雌、雄個體均擴增出一條約200bp的目的片段，初步說明雌雄中華絨螯蟹基因組中均存在SRY盒區(qū)相關基因(Sox基因)。測序后，共得到兩種不同序列：序列ES1和序列ES2，其片段長度均為220bp，可編碼73個氨基酸。 根據ES1和E

3、S2序列分別設計兩對特異引物，并以管家基因beta-actin作陽性對照，研究ES1和ES2基因在中華絨螯蟹精巢、肌肉、心臟、肝臟、鰓、胸神經團等組織以及不同發(fā)育時期的卵巢中的表達情況。結果顯示，ES1在檢測的所有組織中均有表達，而ES2則只在性腺及排出的成熟卵中有表達，在其它組織中均無表達。這一檢測結果說明ES2可能與性別分化或早期胚胎發(fā)育有關。 以性腺特異表達的ES2基因為基礎，設計引物進行5’RACE和3’RACE擴增。將

4、測得的序列拼接后得到長為957bp的序列，其中包括3’非編碼區(qū)108bp(不包括PolyA)和835bp的閱讀框，可編碼278個氨基酸。經序列比對及構建系統(tǒng)樹后將其定名為EsSox2ib。其蛋白序列中包括所有Sox基因的保守序列HMG盒區(qū)，還包括位于HMG盒區(qū)C端的轉錄調節(jié)區(qū)多聚丙氨酸區(qū)。果蠅及意大利蜜蜂的Sox21b基因主要在其胚胎及卵子中有表達，說明它參與胚胎的發(fā)育過程，本文中沒有檢測EsSox21b基因在中華絨螯蟹胚胎中的表達情況

5、，但是在其排出的成熟卵中檢測到EsSox21b有較強的表達，說明它有可能作為內源RNA參與中華絨螯蟹早期的胚胎發(fā)育過程。根據所得的cDNA序列在非編碼區(qū)設計引物對基因組DNA進行擴增，測序結果表明EsSox21b基因沒有內含子。另外，精巢中的EsSox21b序列與排出的成熟卵中的轉錄本相比，有兩個堿基位點的突變和三個堿基的缺失，這種現(xiàn)象分別是由RNA編輯中的堿基替換和核苷酸刪除編輯造成的。因此，依據精巢中Essox21b轉錄本所推導出的

6、氨基酸序列與成熟卵子中的序列相比有兩個氨基酸殘基的差異，說明EsSox21b蛋白在兩種性腺中發(fā)揮作用時需要不同型的蛋白體。 2.Dmrt2基因保守區(qū)的克隆與組織表達 參照多個物種的Dmrt基因DM保守區(qū)序列設計簡并引物對雌雄中華絨螯蟹的基因組DNA進行擴增，結果雌雄均擴增出一條約為150bp的條帶。測序后，最終得到一條138bp的Dmrt基因片段，可編碼46個氨基酸序列。經NCBI中blast搜索后發(fā)現(xiàn)它與人類的Dmrt

7、2最為接近，氨基酸同源性為91％，所以將此Dmrt序列命名為EsDmrt2。與其它物種的Dmrt2基因保守區(qū)的序列比較發(fā)現(xiàn)，它與羅氏沼蟲F的Dmrt2的氨基酸序列完全相同，與脊椎動物的Dmrt2基因相比，有三個氨基酸的差異，但是鋅指結構所必需的氨基酸位點是完全保守的。這說明Dmrt基因在進化上非常保守，在進化等級越近的物種間保守性越高。 根據已測得的Dmrt2基因保守區(qū)序列設計一對特異引物，并以beta-actin作陽性對照，檢