中華絨螯蟹蛻皮抑制激素（MIH）基因的表達、純化及抗體制備.pdf

1、甲殼動物的個體發(fā)育伴隨有周期性的蛻皮過程，該過程由蛻皮抑制激素fMolt-inhibiting hormone，MIH)和蛻皮激素(ecdysone)相互拮抗來調(diào)控。MIH屬于甲殼動物高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone，CHH)家族神經(jīng)肽。除MIH外，CHH家族神經(jīng)肽還包括高血糖激素、性腺抑制激素(Gonad-inhibiting hormone，GIH)和大顎器官抑制激素(Mandibular

2、 organ-inhibiting hormone，MOIH)。這些激素成熟肽的分子量約7-9 kD，通常由70-78個氨基酸殘基組成，氨基酸序列相似，均有6個保守的半胱氨酸殘基，形成3個二硫鍵。該家族神經(jīng)肽由甲殼動物的眼柄X-器官竇腺復(fù)合體合成和分泌，具有調(diào)節(jié)甲殼動物的血糖以及調(diào)控生殖、生長和發(fā)育等重要生理過程的功能。 盡管最近在MIH的結(jié)構(gòu)和功能的理解上取得了一些進展，但仍有許多重要的問題有待回答。MIH詳細的作用機制還

3、不清楚，在生長發(fā)育過程中的表達情況也還不十分清楚。為確定MIH的結(jié)構(gòu)、功能和分子作用機制，我們進行了Ers-MIHl基因的體外表達的研究，并對融合蛋白進行了初步純化、鑒定及復(fù)性，制備了相應(yīng)的多克隆抗體。 第一章：甲殼動物眼柄神經(jīng)激素的研究概述 蝦蟹類眼柄內(nèi)分泌系統(tǒng)主要由類似于脊椎動物的下丘腦神經(jīng)垂體系統(tǒng)的X-器官竇腺復(fù)合體(x-organ sinus gland complex)組成，能夠合成一些調(diào)控生殖、發(fā)育和蛻皮

4、的神經(jīng)激素。目前已從蝦蟹類甲殼動物的眼柄中分離純化出6種激素，均為肽類激素。本章主要對蝦蟹類的眼柄神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、激素的種類及其生理生化特性，特別是基因結(jié)構(gòu)及克隆等方面作了綜述，為進一步開展蝦蟹類內(nèi)分泌學研究提供參考資料。 第二章：中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1(Ers-MIHl)基因的原核表達載體的構(gòu)建 蛻皮抑制激素(molt-inhibiting hormone，MIH)屬甲殼動物高血糖激素(cmstacean

5、hyperglycemic hormone，CHH)家族。MIH抑制Y-器官蛻皮激素的合成從而抑制蛻皮。本研究用DNA重組技術(shù)，根據(jù)中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1(Eriocheir japonica sinensis molt-inhibiting hormone-1，Ers-MIHl)基因序列設(shè)計引物進行PCR擴增，經(jīng)TA克隆測序鑒定后，用BamHI，Hind Ⅲ雙酶切，并純化目的片段亞克隆至原核表達載體pET-28a(+)中。用PCR結(jié)

6、合雙酶切的方法鑒定陽性克隆，并通過核酸測序驗證。結(jié)果顯示成功構(gòu)建了原核表達載體pET-MIHl。 第三章：Ers-MIHl基因融合蛋白在大腸桿菌中的表達 將構(gòu)建好的原核表達質(zhì)粒pET-MIHl轉(zhuǎn)入表達菌株BL21(DE3)中，37℃終濃度為1mmol／L的IPTG下不同時間誘導表達，得到pET-MIHl的融合蛋白。SDS-PAGE分析表明，誘導3 h發(fā)現(xiàn)有大量pET-MIHI融合蛋白表達，在分子量為12 kD處有1

7、條特異的蛋白條帶。融合蛋白表達產(chǎn)物分布顯示，多數(shù)以包涵體形式存在于超聲波破碎處理后的沉淀中。中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1融合蛋白的成功表達為進一步深入研究MIH的功能和分子作用機制奠定了基礎(chǔ)。 第四章：Ers-MIHl基因融合蛋白的純化與復(fù)性研究 將誘導表達的重組蛋白pET-MIHl菌液，經(jīng)過超聲波破碎處理后，收集上清和沉淀，并分別進行純化。對于上清可溶性蛋白的親和層析柱純化并未獲得較高純度的目的蛋白。通過對包涵體的洗

8、滌、變性、復(fù)性以及進一步的純化的摸索，期望獲得較高純度的具有活性的重組蛋白MItI，用于后續(xù)功能的研究。 第五章：Ers-MIHl多克隆抗體的制備 以8 mol／L尿素溶解的pET-MIHl包涵體作為免疫原，免疫BALB／c小鼠制備多克隆抗體。獲得了高效價(1:10 000)抗體，ELISA和Western blot的結(jié)果表明制備的抗體效價高、特異性強。 第六章：中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1(Ers-MIHl

9、)基因的真核表達載體的構(gòu)建根據(jù)真核表達載體畢赤酵母pPIC9的多克隆酶切位點，設(shè)計引物擴增獲得Ers-MIHl基因成熟肽部分序列。經(jīng)TA克隆測序鑒定后，提取質(zhì)粒并雙酶切后純化目的片段克隆到真核表達載體pPIC9中，用PCR結(jié)合雙酶切的方法鑒定，核酸測序驗證。重組質(zhì)粒pPIC9-MIHl雙酶切后得到預(yù)計大小的目的片段，測序結(jié)果顯示插入基因為目的基因，未發(fā)生基因讀碼框移。成功構(gòu)建了真核表達載體。在引物設(shè)計時加入6His純化標簽，為后續(xù)重組蛋