中華絨螯蟹、羅氏沼蝦CyclinB基因cDNA克隆及其在卵子發(fā)生過程中表達分析.pdf

1、本論文通過基因表達分析探討了CyclinB在中華絨螯蟹和羅氏沼蝦卵母細胞減數分裂成熟中的作用，對于了解蝦蟹類卵母細胞成熟分裂機制具有重要學術價值，同時也可為生產上人工控制卵子成熟提供參考。 Cyclin B結合催化亞基Cdc2激酶形成促細胞成熟因子(MPF)，從而參與調控了動物卵母細胞減數分裂。盡管Cyclin B的調控作用在很多種真核生物報道過，但是在甲殼動物中報道很少。本實驗應用簡并PCR和RACE方法第一次從中華絨螯蟹卵巢

2、中克隆了cyclin B cDNA全長序列。該序列全長3,794 bp,包含編碼410個氨基酸的開放閱讀框和超長的的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)(2.4kb)。超長3’UTR存在潛在的翻譯正調控元件TCE和轉錄后負調控元件K box(TGTGAT)。RT-PCR結果顯示，cyclin B mRNA僅分布在卵巢、精巢和心臟組織中。在卵巢不同發(fā)育時期存在分化表達，在卵黃發(fā)生前的未成熟卵巢中表達量最高，卵黃發(fā)生前期和中期表達較低，在卵黃發(fā)生末期

3、(lVt)和生發(fā)泡破裂(GBVD)期表達顯著上升，表明CyclinB在卵原細胞的有絲分裂和卵母細胞減數分裂過程有著緊密聯系。 蛻皮激素是一類所有節(jié)肢動物所含有的一種類固醇激素。在果蠅中，蛻皮激素被證明能夠誘導昆蟲卵母細胞減數分裂的重啟。本實驗通過體外注射的方法來探討蛻皮激素對羅氏沼蝦卵母細胞成熟分裂的誘導作用。每尾雌蝦注射蛻皮激素工作液(10ng/g)，直至全部蛻皮，對照組同時注射等量的1.2％的生理鹽水。自然成熟組不注射任何試

4、劑在同樣飼養(yǎng)條件下自然成熟。激素實驗組羅氏沼蝦注射第一天開始蛻皮并在7天內全部蛻皮。自然成熟實驗組第7天才有蝦蛻皮在14天內全部蛻皮，而對照組在7天內沒有發(fā)生蛻皮。進一步通過組織細胞觀察發(fā)現激素實驗組和自然成熟實驗組生殖蛻皮10h后卵母細胞才完全進入減數分裂中期，表明了體外注射蛻皮激素能夠提前誘導羅氏沼蝦生殖蛻皮從而使得卵母細胞的減數分裂的重啟提前。 為了從分子水平來探討蛻皮激素對羅氏沼蝦卵母細胞減數分裂重啟的誘導作用，進一步研

5、究了蛻皮激素對CyclinB基因表達的影響。首先，通過簡并引物RT-PCR和RACE的方法克隆得到了羅氏沼蝦CyclinB的cDNA全長。通過Real-timeRT-PCR檢測，發(fā)現CyclinB mRNA在羅氏沼蝦卵母細胞最終成熟過程中存在著差異表達，表明了CyclinB基因與羅氏沼蝦減數分裂重啟有著緊密關系。蛻皮激素實驗組CyclinB基因在蛻皮5h、10h和14h表達量顯著高于自然成熟組。同樣，與對照組相比，注射蛻皮激素能顯著增加

6、CyclinB基因的表達，表明了羅氏沼蝦卵母細胞成熟過程中，蛻皮激素能夠促進CyclinB基因的表達，進一步表明了蛻皮激素卵母細胞減數分裂重啟過程中發(fā)揮了重要作用。 綜上，CyclinB基因在中華絨螯蟹和羅氏沼蝦卵子發(fā)生過程中存在分化表達，特別是在生發(fā)泡破裂時期有著很高的表達，表明了CyclinB與中華絨螯蟹和羅氏沼蝦卵母細胞減數分裂緊密相關。蛻皮激素能夠使羅氏沼蝦生殖蛻皮和生發(fā)泡破裂提前，并能夠促進Cyclin B基因的表達，