中華絨螯蟹短尾化發(fā)育相關(guān)基因的克隆與界定.pdf

1、中華絨螯蟹（Eriocheir japonica sinensis）屬節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda）甲殼亞門（Crustacea）
　　 十足目（Decapoda）爬亞目（Reptantia）短尾部（Brachyura）方蟹科（Grapsidae）絨螯蟹屬，俗稱河蟹、大閘蟹、毛蟹等，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)物種。在其幼體的發(fā)育過(guò)程中有一個(gè)短尾化（brachyurization）的變態(tài)過(guò)程，特別是在大眼幼體期至仔蟹Ⅰ期之間外部形態(tài)

2、發(fā)生顯著改變，例如頭胸部變寬，整個(gè)腹部形狀變扁并反轉(zhuǎn)貼于頭胸部下，腹肢退化、失去游泳功能，雄性個(gè)體甚至失去兩對(duì)腹肢等等。短尾化是短尾類動(dòng)物具有的保守和普遍性發(fā)育模式。至今，關(guān)于短尾類動(dòng)物短尾化變態(tài)的研究多集中在形態(tài)、生理和生態(tài)等方面，對(duì)短尾化變態(tài)發(fā)育調(diào)控基因方面的研究，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 本研究中采用正向和反向抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）
　　

3、 技術(shù)分離中華絨螯蟹幼體發(fā)育過(guò)程中的短尾化變態(tài)發(fā)育特異表達(dá)基因，并用cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）的方法克隆短尾化相關(guān)基因的全長(zhǎng)cDNA序列。然后用半定量和定量RT-PCR對(duì)一些基因在短尾化發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)差異性進(jìn)行研究。
　　 第一章中華絨螯蟹腹部組織抑制性消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及表達(dá)序列標(biāo)簽分析應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了中華絨螯蟹腹部?jī)蓚€(gè)發(fā)育時(shí)期（大眼幼體

4、期和仔蟹Ⅰ
　　 期）的雙向消減cDNA文庫(kù)（SSH文庫(kù)1和SSH文庫(kù)2）。其中以Ⅰ期仔蟹腹部為試驗(yàn)方（Tester），大眼幼體腹部為驅(qū)動(dòng)方（Driver）進(jìn)行正向消減雜交；以大眼幼體腹部為試驗(yàn)方，I期仔蟹腹部為驅(qū)動(dòng)方進(jìn)行反向消減雜交。分別提取大眼幼體和I期仔蟹腹部組織的總RNA、mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，置換法合成第二鏈，然后經(jīng)Rsa I酶切、接頭連接、兩輪消減雜交和兩輪PCR，獲得正、反向消減雜交產(chǎn)物。消減雜交產(chǎn)物

5、經(jīng)純化后克隆入質(zhì)粒表達(dá)載體（pGEM-T easy Vector），轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。最后所獲正向消減文庫(kù)含374個(gè)重組子，反向消減文庫(kù)含985個(gè)重組子。PCR擴(kuò)增鑒定正、反向消減cDNA文庫(kù)的插入片段平均大小分別約為440 bp和380 bp，表明所構(gòu)建的消減cDNA文庫(kù)適合進(jìn)一步研究中華絨螯蟹短尾化發(fā)育相關(guān)基因。結(jié)果初步提示中華絨螯蟹的短尾化發(fā)育可能涉及多基因或基因群。進(jìn)一步分析獲得的表達(dá)序列標(biāo)簽序列，結(jié)果表明SSH文庫(kù)1和S

6、SH文庫(kù)2中分別有211個(gè)和669個(gè)非冗余表達(dá)序列標(biāo)簽序列；對(duì)其的聚類分析表明SSH文庫(kù)1包括130個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄本（25個(gè)多拷貝基因和105個(gè)單拷貝基因），而SSH文庫(kù)2包括195個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄本（51個(gè)多拷貝基因和144個(gè)單拷貝基因）。
　　 功能分析顯示這些基因可能參與各種細(xì)胞加工、核糖體蛋白質(zhì)合成、蛻皮、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育、能量代謝、免疫與壓力調(diào)控等。
　　 第二章中華絨螯蟹腹部組織RACE cDNA文庫(kù)的構(gòu)建運(yùn)用SMART

7、技術(shù)，構(gòu)建了中華絨鰲蟹腹部組織（仔蟹I期和大眼幼體期）SMART RACEcDNA文庫(kù)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，文庫(kù)所含全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度主要集中在750一2000bp之間。RACE PCR結(jié)果表明，所用基因特異性引物與接頭引物皆能擴(kuò)增出產(chǎn)物，說(shuō)明所構(gòu)文庫(kù)的質(zhì)量較好，適于用RACE方法從中分離中華絨鰲蟹短尾化發(fā)育相關(guān)基因的全長(zhǎng)cDNA。
　　 第三章中華絨螯蟹熱激蛋白90基因全長(zhǎng)cDNA克隆、mRNA表達(dá)定量分析和序列分析熱激蛋

8、白家族中分子量為90kDa的熱激蛋白90（HSP90）是真核細(xì)胞胞質(zhì)中最豐富和高度保守的蛋白質(zhì)之一。根據(jù)EST分析結(jié)果，分別用5' RACE和3' RACE技術(shù)從中華絨螯蟹基因組中獲得了一個(gè)熱激蛋白90基因（命名為EjsHSP90）的全長(zhǎng)cDNA序列。EjsHSP90cDNA全長(zhǎng)為2,517bp并包含一個(gè)2,157bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)82.85kDa的氨基酸多肽。該蛋白質(zhì)具有熱激蛋白90家族的顯著特征并有一個(gè)ATPase結(jié)合域；序

9、列比對(duì)顯示EjsHSP90與其他動(dòng)物的HSP90分享79—96％的序列相似度并具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)特征。用RT-PCR方法對(duì)該基因的表達(dá)譜進(jìn)行了研究，同時(shí)用熒光定量PCR方法對(duì)該基因在三個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的三種類型組織樣品中的表達(dá)差異性進(jìn)行了進(jìn)一步分析。結(jié)果表明該基因在三個(gè)發(fā)育時(shí)期的不同組織中均有表達(dá)且表達(dá)水平變化明顯（P＜0.05），其在仔蟹I期的腹部表達(dá)量最高且明顯高于在其他組織部位的表達(dá)量，而且熒光定量PCR結(jié)果排除了EjsHSP90m

10、RNA在仔蟹I期腹部的高表達(dá)主要由滲透性應(yīng)激誘導(dǎo)的可能性。另外，以熱激基因進(jìn)行的相關(guān)系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明其能為節(jié)肢動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系重建提供有益信息和補(bǔ)充證據(jù)。
　　 第四章中華絨螯蟹錨蛋白基因全長(zhǎng)cDNA克隆、mRNA表達(dá)定量分析和序列分析錨蛋白（Ankyrins）家族是一類在膜蛋白和細(xì)胞支架蛋白等之間起橋梁作用的銜接分子。
　　 根據(jù)EST分析結(jié)果，分別用5'RACE和3'RACE技術(shù)從中華絨螯蟹基因組中獲得了一個(gè)錨蛋

11、白基因（命名為EjsANK）的全長(zhǎng)cDNA序列。EjsANK cDNA全長(zhǎng)為4,375bp并包含一個(gè)1,095bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)40.23kDa的含364個(gè)氨基酸的多肽。EjsANK cDNA具一個(gè)獨(dú)特的長(zhǎng)為3,073 bp的3'-非翻譯區(qū)，包含三個(gè)K-box功能域、一個(gè)GY-like box功能域和一個(gè)Brd-like box功能域。序列比對(duì)和三維結(jié)構(gòu)分析表明EjsANK蛋白是錨蛋白家族一個(gè)新的胞質(zhì)蛋白成員。
　　 用

12、RT-PCR方法對(duì)該基因的表達(dá)譜進(jìn)行了研究，同時(shí)用熒光定量PCR方法對(duì)該基因在三個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的三種類型組織樣品中的表達(dá)差異性進(jìn)行了進(jìn)一步分析。結(jié)果表明該基因在三個(gè)發(fā)育時(shí)期的不同組織中均有表達(dá)但腹部組織表達(dá)水平變化最明顯（P＜0.05），其在仔蟹I期的腹部表達(dá)量最高且明顯高于在其他組織部位的表達(dá)量。對(duì)該基因的功能進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析表明其和IκB蛋白具有高度類似的功能，IκB蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中IκB/NF-κB復(fù)合物的關(guān)鍵組成因子，

13、該復(fù)合物已被證實(shí)在多種生物發(fā)育過(guò)程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明EjsANK基因很可能參與中華絨螯蟹的早期發(fā)育調(diào)控，特別是幼體的短尾化發(fā)育調(diào)控。
　　 第五章中華絨螯蟹增殖細(xì)胞核抗原基因全長(zhǎng)cDNA克隆、mRNA表達(dá)定量分析和序列分析增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。根據(jù)EST 分析

14、結(jié)果，分別用5'RACE和3'RACE技術(shù)從中華絨螯蟹基因組中獲得了一個(gè)增殖細(xì)胞核抗原基因（命名為EjsPCNA）的全長(zhǎng)cDNA序列。EjsPCNA cDNA全長(zhǎng)為1,123bp并包含一個(gè)780bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)28.62kDa的含259個(gè)氨基酸的多肽；編碼的氨基酸序列包含保守的結(jié)構(gòu)域間連接loop、核心loop和C-端尾。通過(guò)序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)生分析、序列結(jié)構(gòu)比較和一些生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，表明EjsPCNA蛋白是PCNA家族成員

15、。用RT-PCR方法對(duì)該基因的表達(dá)譜進(jìn)行了研究，同時(shí)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)該基因在三個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的兩種類型組織樣品中的表達(dá)差異性進(jìn)行了進(jìn)一步分析。結(jié)果表明該基因在三個(gè)發(fā)育時(shí)期的不同組織中均有表達(dá)，但在頭胸部組織的表達(dá)水平變化明顯（P＜0.05），在仔蟹I 期的頭胸部表達(dá)量最高且明顯高于在其它時(shí)期頭胸部和腹部組織的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明中華絨螯蟹的EjsPCNA基因表達(dá)水平的變化與其發(fā)育階段形態(tài)變化和身體的細(xì)胞增殖活動(dòng)具有緊密聯(lián)系

16、，提示EjsPCNA基因參與中華絨螯蟹的早期發(fā)育，該基因也可作為細(xì)胞增值的標(biāo)記。
　　 第六章中華絨螯蟹翻譯起始因子4G基因全長(zhǎng)cDNA克隆和序列分析翻譯起始因子4G（eIF4G）作為骨架蛋白對(duì)eIF3起募集反應(yīng)，并充當(dāng)eIF4E和eIF4A之間的分子橋梁；它位于復(fù)合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心，在蛋白表達(dá)過(guò)程中起決定作用。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)EST 分析結(jié)果，分別用5'RACE和3'RACE技術(shù)從中華絨螯蟹基因組中獲得了一個(gè)真核生物翻譯起始因子基因（

17、命名為EjseIF4G）的全長(zhǎng)cDNA序列，EjseIF4G cDNA全長(zhǎng)為3,055bp并包含兩個(gè)開放閱讀框，ORF1有963個(gè)堿基，ORF2有798個(gè)堿基，它們編碼一個(gè)78.62kDa的含693個(gè)氨基酸的多肽EjseIF4G，編碼的氨基酸序列包含保守的MIF4G結(jié)構(gòu)域、MA3結(jié)構(gòu)域和W2/eIF5C 結(jié)構(gòu)域。通過(guò)序列同源性比對(duì)、序列結(jié)構(gòu)比較和一些生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明EjseIF4G蛋白是eIF4G家族成員，它為非分泌蛋白，不