擬穴青蟹卵子發(fā)生過程中若干相關(guān)基因的克隆與分析.pdf

1、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）系是我國東南沿海重要的海洋經(jīng)濟(jì)蟹類之一。卵子質(zhì)量在人工育苗中的重要性越來越受到重視。一直以來,人們主要開展對(duì)甲殼動(dòng)物卵子發(fā)生過程的細(xì)胞生物學(xué)研究。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，與甲殼動(dòng)物卵子發(fā)生過程密切相關(guān)的基因克隆和表達(dá)的研究成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)，因此研究擬穴青蟹卵子發(fā)生過程中相關(guān)基因具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。
　　本研究通過擬穴青蟹性腺EST的分析、SMART-R

2、ACE技術(shù)或RT-PCR技術(shù)克隆獲Sp-vasa、卵黃膜外層蛋白1（vitelline membrane outer layer proteins1，vmo-1）、卵黃蛋白原（Vitellogenin，vtg）基因全長(zhǎng)cDNA序列和卵黃蛋白原受體（vitellogenin receptor，vgr）的cDNA序列片段，同時(shí)采用半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析各基因在各器官、卵巢各發(fā)育階段的表達(dá)情況及Sp-vtg mRNA在肝胰腺的表

3、達(dá)情況。結(jié)果如下：
　?。?）Sp-vasa的cDNA序列全長(zhǎng)2851 bp，包括240 bp的5’非編碼區(qū)域、692 bp的3’非編碼區(qū)（去除polyA部分）和1896 bp的開放閱讀框，該開放閱讀框可編碼631個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為68.756 kDa。半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR均顯示，Sp-vasa基因在精巢和卵巢中特異表達(dá)，而且Sp-vasa mRNA隨著卵巢的成熟表達(dá)呈下降趨勢(shì)，在發(fā)育階段卵巢的表達(dá)量高于成熟階段（P

4、<0.05）。
　?。?）Sp-vmo-1的cDNA序列全長(zhǎng)923 bp，包括28 bp的5’非編碼區(qū)域，173 bp的3’非編碼區(qū)域（去除polyA部分）和693 bp的開放閱讀框，該開放閱讀框可編碼231個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為24.782 kDa。半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR均顯示，Sp-vmo-1基因只在卵巢中表達(dá)，且Sp-vmo-1 mRNA在第Ⅰ和Ⅳ期卵巢表達(dá)量高于比其它期的表達(dá)量。
　　（3）Sp-vtg的cD

5、NA序列全長(zhǎng)7816 bp，包括19 bp的5’非編碼區(qū)域，90 bp3’非編碼區(qū)（除去polyA部分）和7683 bp開放閱讀框，該開放閱讀框可編碼2560個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的分子量為287.743 kDa。半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR均顯示，Sp-vtg基因在卵巢和肝胰腺特異表達(dá)，而且在肝胰腺中Sp-vtg基因的表達(dá)量高于在卵巢中的表達(dá)量（P<0.05）；Sp-vtg mRNA隨著卵巢的成熟表達(dá)呈升高趨勢(shì)；Sp-vtg mRNA

6、在肝胰腺中的表達(dá)量隨著性腺成熟指數(shù)的升高而升高，到第Ⅳ期以后表達(dá)處于穩(wěn)定階段。
　?。?）Sp-vgr基因部分cDNA序列747 bp，該序列包括203bp3’非編碼區(qū)（除去polyA部分）。Sp-vgr基因只有在卵巢中特異表達(dá)。Sp-vgr mRNA隨著卵巢的成熟表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，在第Ⅱ期達(dá)到最高。
　　本研究同時(shí)也采用原位雜交技術(shù)分析各基因在卵子發(fā)生過程中的定位表達(dá)情況，結(jié)果表明：
　　1）Sp-vasa

7、mRNA在第Ⅰ期定位在卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，在第Ⅲ期定位在濾泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞核周圍，而在第Ⅴ期主要定位在卵母細(xì)胞核周圍，而且在第Ⅰ、Ⅲ期的雜交信號(hào)明顯高于第Ⅴ期；
　　2）Sp-vmo-1 mRNA在第Ⅰ期主要定位在濾泡細(xì)胞中，在第Ⅲ期除定位在濾泡細(xì)胞外，在卵母細(xì)胞核內(nèi)也有信號(hào)，在第Ⅴ期主要定位在細(xì)胞核，而且Sp-vmo-1 mRNA在第Ⅰ期的雜交信號(hào)明顯高于第Ⅲ和Ⅴ期；
　　3）Sp-vtg mRNA在卵子發(fā)生過程中呈由弱到強(qiáng)的

8、趨勢(shì)，而且在第Ⅰ期主要定位在卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，在第Ⅲ期主要定位在卵母細(xì)胞的核周圍中，在濾泡細(xì)胞也有微弱的雜交信號(hào)，在第Ⅴ期主要定位在卵母細(xì)胞核內(nèi)；Sp-vtg mRNA在肝胰腺各期主要定位在肝胰腺的細(xì)管（T）中，而且雜交信號(hào)呈由弱到強(qiáng)的趨勢(shì)，特別在第Ⅴ期有相當(dāng)強(qiáng)的信號(hào)。
　　4）Sp-vgr mRNA在第Ⅰ期主要定位在卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，在第Ⅲ期主要定位在卵細(xì)胞的核中，在濾泡細(xì)胞也有信號(hào)，在第Ⅴ期主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，而且Sp-vgr m