擬穴青蟹基于轉(zhuǎn)錄組的分子標(biāo)記篩選與遺傳規(guī)律分析.pdf

1、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、短尾亞目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹屬(Scylla),廣泛分布在我國東南沿海水域。近年來隨著擬穴青蟹養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,對(duì)擬穴青蟹苗種的需求量逐漸增大,因此對(duì)擬穴青蟹優(yōu)良品種的選育就顯得非常重要,而分子標(biāo)記的開發(fā)是擬穴青蟹品種選育和遺傳規(guī)律研究的基礎(chǔ)。本研究基于454高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)擬

2、穴青蟹微衛(wèi)星標(biāo)記,以及采用溶解曲線法開發(fā)擬穴青蟹轉(zhuǎn)錄組水平SNPs標(biāo)記;根據(jù)已分離的微衛(wèi)星序列獲得多態(tài)性引物155對(duì),并以中國海南擬穴青蟹家系為研究材料,對(duì)擬穴青蟹遺傳規(guī)律進(jìn)行分析。獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.隨機(jī)從擬穴青蟹轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序所得的大量序列中選取含有微衛(wèi)星的DNA序列,利用Primer Premier5.0軟件共設(shè)計(jì)引物263對(duì),其中67對(duì)表現(xiàn)出多態(tài)性。這67對(duì)微衛(wèi)星引物共檢測(cè)到556個(gè)等位基因,每個(gè)位點(diǎn)的等位基因

3、數(shù)位2～27,平均等位基因數(shù)為8.3個(gè)。有效等位基因?yàn)?.3～19.7,平均為5.1;多態(tài)信息含量(PIC)、觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別位于0.215~0.946之間、0.1888～1.000之間和0.230～0.963之間,平均值分別為0.899、0.703和0.736。經(jīng)Bonferroni校正后,有10個(gè)位點(diǎn)偏離了哈代-溫伯格平衡(PH-W<0.0007)。這一結(jié)果表明,67個(gè)SSR標(biāo)記具有較高的多態(tài)信息含量,用于

4、擬穴青蟹群體遺傳學(xué)多樣性研究具有一定的可靠性和可信性。
　　2.本研究根據(jù)454高通量測(cè)序所獲得的擬穴青蟹轉(zhuǎn)錄組候選SNP序列設(shè)計(jì)引物,并采用熒光定量PCR系統(tǒng)對(duì)擬穴青蟹的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分型驗(yàn)證。通過對(duì)候選的序列進(jìn)行測(cè)序、拼接,獲得包含91個(gè)候選SNP位點(diǎn)的19個(gè)序列,全長(zhǎng)為13311bp,平均每146bp含有一個(gè)SNP位點(diǎn)。采用溶解曲線法對(duì)野生群體的30個(gè)樣本進(jìn)行分型,其中40個(gè)SNP位點(diǎn)被成功分型,次要等位基因頻率的分布范圍

5、在0.017和0.500之間。觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.000～0.600和0.033～0.509,平均值分別為0.142和0.239。通過哈-溫平衡和連鎖不平衡檢測(cè),17個(gè)SNP位點(diǎn)偏離哈代-溫伯格平衡。經(jīng)Bonferroni校正后,各位點(diǎn)之間沒有明顯的連鎖不平衡現(xiàn)象(P>0.00125)。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示:17個(gè)SNP位點(diǎn)位于注釋基因序列中,這些基因包括精氨酸激酶基因(arginine kinase)、金

6、屬硫蛋白(metallothionein)、類胰蛋白酶基因(trypsin-like(TRY3) gene)、β-肌動(dòng)蛋白基因(beta-actin gene)、vasa-like蛋白基因。這些SNP標(biāo)記將為擬穴青蟹群體遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建以及分子標(biāo)記遺傳育種提供新型分子標(biāo)記。
　　3.采用155對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)擬穴青蟹作圖家系進(jìn)行遺傳規(guī)律分析,其中49對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在家系中出現(xiàn)分離。利用這49對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)親本和95個(gè)子代進(jìn)

7、行基因分型,結(jié)果表明:在雌雄親本中無多態(tài)性而在后代中出現(xiàn)分離的標(biāo)記有11個(gè)(親本基因型為AB×AB),這些位點(diǎn)不能用于標(biāo)記的連鎖分析;母本分離標(biāo)記有34個(gè),其中8個(gè)偏離了孟德爾分離規(guī)律(P<0.05),3個(gè)嚴(yán)重偏離;父本分離標(biāo)記有31個(gè),其中9個(gè)偏離了孟德爾分離規(guī)律(P<0.05),5個(gè)嚴(yán)重偏離;在父母本中均出現(xiàn)分離的標(biāo)記有27個(gè)。利用JoinMap軟件對(duì)父、母本分離標(biāo)記進(jìn)行分析結(jié)果顯示,在雌性標(biāo)記的連鎖分析中,僅有6個(gè)標(biāo)記呈現(xiàn)連鎖現(xiàn)象