青甌柑S-SAP標(biāo)記與楊梅轉(zhuǎn)錄組多態(tài)性cSSRs標(biāo)記篩選策略研究.pdf

1、甌柑（Citrus suavissima Hort.ex Tanaka）是浙江南部最具特色的地方柑橘栽培品種，青甌柑是于2005年所發(fā)現(xiàn)的普通甌柑芽變新種類，但目前尚無可用于早期鑒別的特異分子標(biāo)記。楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.，Myricaceae）是原產(chǎn)我國(guó)的特產(chǎn)果樹，我國(guó)有著豐富的資源，但其可用的多態(tài)性cSSRs(cDNA-SSRs)比較缺乏。為此，本研究旨在開發(fā)青甌柑特異S-SAP標(biāo)記以及建立基于轉(zhuǎn)錄

2、組的楊梅多態(tài)性cSSRs標(biāo)記的篩選策略。研究取得了以下主要結(jié)果。
　　 1、對(duì)經(jīng)典S-SAP標(biāo)記技術(shù)做了調(diào)整，建立了甌柑EcoRⅠ單酶切S-SAP標(biāo)記技術(shù)體系，并且從EAT和C12選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中，篩選出了一條長(zhǎng)約250bp特異于青甌柑的S-SAP標(biāo)記。對(duì)該標(biāo)記條帶進(jìn)行了克隆測(cè)序，確定其長(zhǎng)度為247bp該標(biāo)記十分穩(wěn)定，可以直接用來證明青甌柑是普通甌柑的真實(shí)芽變。該標(biāo)記相應(yīng)的EcoRⅠ單酶切S-SAP標(biāo)記技術(shù)分析體系，也能夠?yàn)榍喈T

3、柑新品種審定和種苗鑒定提供技術(shù)支持;該技術(shù)體系也可以為其他果樹同類研究提供技術(shù)參考。同時(shí)，本研究也克隆出了4條甌柑的RNaseH-LTR片段序列，可用于近緣柑橘種類品種的S-SAP分析研究。
　　 2、從楊梅‘荸薺’轉(zhuǎn)錄組的UniGenes序列鑒別出了6883個(gè)cSSR位點(diǎn)，相應(yīng)的cSSR位點(diǎn)分布頻率為1個(gè)cSSR位點(diǎn)/3.2Kb。在所有cSSR位點(diǎn)當(dāng)中，重復(fù)序列長(zhǎng)度小于或等于12bp cSSR位點(diǎn)約占58％，14-22bp c

4、SSR位點(diǎn)約占35％，等于或長(zhǎng)于24bp的cSSR位點(diǎn)約占7％;二核苷酸和三核苷酸cSSR位點(diǎn)是主要類型，兩者所占比例超過75％，AG/CT和AAG/CTT分別在二核苷酸和三核苷酸cSSR位點(diǎn)中所占比例最高，同其他類型cSSR位點(diǎn)一樣，它們的數(shù)量隨著重復(fù)次數(shù)增加而減少。在所有楊梅轉(zhuǎn)錄組cSSRs中，有594個(gè)復(fù)合cSSRs，其約占總cSSRs的10％。楊梅轉(zhuǎn)錄組上有5914 cSSRs被系統(tǒng)地分為11類。此5914 cSSRs共包含63

5、30個(gè)cSSR位點(diǎn)，占楊梅轉(zhuǎn)錄組總cSSR位點(diǎn)數(shù)的92.0％。
　　 3、基于11類cSSRs的多態(tài)性比較分析，本研究設(shè)計(jì)出了楊梅轉(zhuǎn)錄組多態(tài)性cSSRs標(biāo)記篩選的策略。該策略為:首先，優(yōu)先選取2-ntL、Compound B、Compound A cSSRs和Compound D這四類cSSRs進(jìn)行篩選多態(tài)性cSSRs;其次，從3-ntL中，可以快速獲取大量的多態(tài)性cSSRs;此外，2-ntM cSSRs可以用于從中篩選出多態(tài)性