HLA區(qū)間11個(gè)遺傳標(biāo)記多態(tài)性與鼻咽癌的相關(guān)性研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是一種起源于鼻咽上皮的惡性腫瘤，好發(fā)于中國(guó)南方諸省及香港、臺(tái)灣、新加坡華人群體，流行病學(xué)調(diào)查顯示男、女性發(fā)病率約為2-3:1。目前認(rèn)為鼻咽癌系由遺傳因素、EB病毒(Epstein-Barr Virus)持續(xù)感染及環(huán)境因素等共同作用所致，是一種多基因遺傳性疾病，涉及多個(gè)遺傳易感位點(diǎn)。編碼人類白細(xì)胞抗原(Human Leucocyte Antigen，HLA)的基因復(fù)合體定位

2、于6P21.3，既往研究發(fā)現(xiàn)HLA-B*35、B*38、B*46、B*58與不同地域華人鼻咽癌相關(guān)。 MHC-I類鏈相關(guān)基因A(MHC Class-I Chain Related Gene A,MICA)位于HLA-B基因近著絲粒端46kb，含6個(gè)外顯子，所編碼MICA分子為跨膜糖蛋白，其中，第5外顯子編碼跨膜區(qū)。MICA分子是重要的細(xì)胞應(yīng)激(Cell Stress)分子，MICA分子結(jié)合NKG2D/DAPIO受體，激活NK細(xì)胞

3、、CD8+T細(xì)胞、Y δ T細(xì)胞以清除病毒感染細(xì)胞、突變細(xì)胞。 第一部分工作研究MICA基因第5外顯子(GCT)n序列重復(fù)多態(tài)性(MICA-Short Tandem Repeat polymorphism，MICA-STR)與湖南地區(qū)漢族人群鼻咽癌的相關(guān)性。 采用熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一基因掃描(Polymerase Chain Reaction/Size-Sequencing，PCR/Size-Sequencing)和聚合

4、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一序列特異性引物技術(shù)(PolymeraseChain Reaction/Sequence Specific Priming，PCR/SSP)分析湖南地區(qū)一組漢族NPC患者(218例)和該地區(qū)一組正常漢族對(duì)照人群(196例)的MICA-STR等位基因及MICA基因缺失(MICA*Del)頻率。結(jié)果顯示，MICA*A9頻率在患者組顯著高于對(duì)照組(Pc=0.0001002，OR=2.528，95％CI=1.636-3.907)，MI

5、CA*A5.1頻率在患者組顯著低于對(duì)照組(P<,c>=0.006，OR=0.594，95％CI=0.437-0.806)。按性別分層的比較顯示，MICA*A9在男性患者組頻率顯著高于男性對(duì)照組(Pc=0.000072，OR=3.255，95％CI=1.855-5.709)，MICA*A5.1在男性患者組的頻率顯著低于男性對(duì)照組(P<,c>=0.000737，OR=0.486，95％CI=0.337-0.702)；各MICA-STR等位基

6、因頻率在女性患者組、女性對(duì)照組之間的差異無(wú)顯著性(P<,c>>0.05)。進(jìn)一步的分析顯示，MICA*A9與NPC的關(guān)聯(lián)同性別之間存在顯著交互作用 (X<,w><'2>=41.58，P=0.0001)；在男性組，MICA*A5.1、MICA*A9與NPC的關(guān)聯(lián)均存在基因拷貝數(shù)的劑量依賴關(guān)系；MICA*A5.1/MICA*A9雜合子的OR值明顯高于其它MICA*A5.1攜帶者，但低于其它MICA,A9攜帶者。為建立湖南地區(qū)漢族人群MICA

7、-STR，HLA-B單倍型數(shù)據(jù)庫(kù)，并闡明該人群MICA*AS.1、MICA*A9與HLA-B基因之間的連鎖關(guān)系。 第二部分工作采用熒光PCR/Size-Sequencing檢測(cè)MICA-STR等位基因，采用PCR/SSP技術(shù)作HLA-B基因分型及檢測(cè)MICA基因缺失，分析湖南地區(qū)58個(gè)隨機(jī)選擇的漢族正常核心家系共183個(gè)成員HLA-B、MICA-STR等位基因多態(tài)性，對(duì)85份無(wú)血緣關(guān)系的親代樣本數(shù)據(jù)作單倍型多樣性、連鎖不平衡(L

8、inkage Disequilibrium，LD)分析。結(jié)果顯示，170條HLA-B-MICA-STR親代單倍型含30種HLA-B、MICA-STR 組合方式，發(fā)現(xiàn)9種新的連鎖類型；MICA*A9與HLA-B*35、B*38、B*51、B*58 連鎖，并與HLA-B*38、HLA-B*58呈顯著連鎖不平衡(△=0.0364，P<,c>=2.3558*10<'-4>；△=0.0409，P<,c>=2.9830*10<'-4>)：MICA*

9、5.1與HLA-B*07、B08、B*13、B*27、B*37、B*39、B*48、B60連鎖，并與HLA-B60呈顯著連鎖不平衡(A=0.1341，P<,c>=1.6866,10<'-11>)。為闡明MICA-STR與HLA-B基因在NPC相關(guān)性的原發(fā)/繼發(fā)關(guān)系，和鑒定性別特異的NPC遺傳易感HLA單倍型， 第三部分工作對(duì)湖南地區(qū)127例連續(xù)的新發(fā)NPC患者、112例連續(xù)的正常對(duì)照人群(源自第一部分工作的研究對(duì)象)采用PCR/

10、SSP技術(shù)作 HLA-A、B、DRB1基因DNA分型。結(jié)果顯示，HLA-B*35、B*38、B*58與MICA*A9均呈唯一性(Exclusive)連鎖關(guān)系；男性NPC患者組HLA-B*58頻率顯著高于男性對(duì)照組(OR=9.975，95％CI=2.637-37.73，P<,c>=0.0034)；男性NPC患者組HLA-DR17(DRB*03)頻率顯著高于男性對(duì)照組(OR=12.391，95％CI=2.05-75.01，P<,c>=0.0

11、195)；男性NPC患者組HLA-B60 頻率低于男性對(duì)照組，校正P值處于臨界水平(OR=0.416，95％CI=0.22-0.787，P<,c>=0.055)。女性NPC患者組、女性對(duì)照組 HLA-A、B、DRB1 頻率差異無(wú)顯著性。在男性組，當(dāng)HLA-B*58-MICA*A9 單倍型攜帶DR17(DRB1*03)時(shí)，OR 值增至12.391(95％CI=2.05-75.01，P=0.00154)；當(dāng)HLA-B*58-MICA*A9單

12、倍型攜帶其它DRB1基因(Non-HLA-DR17)時(shí)，OR值明顯下降(OR=5.734，95％CI=0.54-60.88，P=0.06)。此外，HLA-A*02、B*46在NPC患者組、對(duì)照組間(含按性別分層后的比較)的頻率差異無(wú)顯著性。 第四部分工作分析位于HLA-I類區(qū)遠(yuǎn)著絲粒端、HLA-A基因側(cè)翼的7個(gè)多態(tài)性標(biāo)記與湖南地區(qū)漢族人群NPC的相關(guān)性。采用熒光PCR/Size-Sequencing技術(shù)對(duì)D6S1624、D6S

13、258、M6S211、D6S510等4個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記作分型，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù) (Amplification Fragment Length Polymorphism，PCR/AFLP)檢測(cè) AluyHF、AluyHG、AluyHJ 的插入/缺失，分析該地區(qū)127例連續(xù)的新發(fā)NPC患者、112例連續(xù)的正常對(duì)照人群(同第三部分工作的研究對(duì)象)上述標(biāo)記的頻率差異。結(jié)果顯示，該4個(gè)微衛(wèi)星、3個(gè)AluyH家族成員的頻率差異

14、在NPC患者組、對(duì)照組間(含按性別分層后的比較)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。 我們的研究結(jié)果首次表明：(1)MICA*A5.1、MICA*A9 與湖南地區(qū)鼻咽癌關(guān)聯(lián)，且呈現(xiàn)性別差異和基因拷貝數(shù)依賴關(guān)系；(2)初步構(gòu)建該人群MICA-STR，HLA-B 單倍型數(shù)據(jù)庫(kù)，并發(fā)現(xiàn)9種新的MICA-STR，HLA-B 連鎖類型；(3)正常參照家系分析和病例-對(duì)照研究均顯示，多個(gè)鼻咽癌相關(guān)HLA-B基因(含B*35、B*38、B*58)與MICA*

15、A9連鎖；(4)HLA-B*58-MICA*A9-DR17(DRB1*03)是該人群男性個(gè)體的一條鼻咽癌遺傳易感HLA單倍型；(5)未發(fā)現(xiàn)HLA-I類區(qū)遠(yuǎn)著絲粒端的7個(gè)多態(tài)性標(biāo)記與湖南地區(qū)漢族人群NPC存在關(guān)聯(lián)，我們提出該區(qū)域DNA遺傳多態(tài)性與NPC關(guān)系的4種可能性。 通過(guò)上述4部分DNA分型研究，我們首次報(bào)道，HLA-B至DRB1基因區(qū)間與湖南地區(qū)漢族人群NPC高度關(guān)聯(lián)，且存在性別差異；我們的數(shù)據(jù)提示MICA*A9為湖南地區(qū)漢

16、族人群鼻咽癌的一個(gè)原發(fā)(Primary)相關(guān)基因，基于MICA*A9與鼻咽癌相關(guān)HLA-B基因的連鎖格局，提示MICA*A9可能為華人人群的一個(gè)共同的NPC易感標(biāo)記；HLA-B*58-MICA*A9-DR17(DRB1*03)單倍型在HLA-B/DRB1區(qū)間存在未被認(rèn)知的遺傳缺陷，能調(diào)制(Modulate)NF-kappaB通路活性，進(jìn)而與MICA*A9產(chǎn)生協(xié)同作用(Synergy)，是進(jìn)一步研究NPC高發(fā)于中國(guó)南方人群和揭示NPC發(fā)病