基于表達序列標簽的玉米單核苷酸多態(tài)性標記開發(fā).pdf

1、單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是由單堿基顛換、轉換、插入或缺失引起的DNA序列變異。與限制性片段長度多態(tài)性(Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP)和簡單重復序列(Simple Sequence Repeat，SSR)等常用分子標記相比，SNP具有分布密度高、遺傳穩(wěn)定、與表型性狀相關性強、檢測簡便、易于實現(xiàn)自動化分析等諸多優(yōu)點，被

2、稱為第三代分子標記。針對SSR分子標記密度不足，現(xiàn)有的SNP分子標記開發(fā)一般只基于兩種基因型的序列差異，用以檢測其他基因型的材料時多態(tài)性不高，不能滿足目前玉米基因精細定位需要的現(xiàn)狀，本研究從公共數(shù)據(jù)庫下載來自不同遺傳背景的玉米表達序列標簽(Expressed Sequence Tag，EST)，運用各種生物信息學軟件和自主編寫的程序，開發(fā)基于EST序列的SNP分子標記，并通過高分辨率熔解（High Resolution Melt，HRM

3、）技術驗證部分標記的多態(tài)性。
　　 以生物信息學理論為基礎，利用Blast、Cross_ Match、Phrap、ePrimer3、e-PCR和自主開發(fā)的Perl腳本程序，基于WindowsXP和Linux操作系統(tǒng)構建數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，并使用Perl語言結合Bioperl模塊編寫的腳本程序讓整個分析過程自動化，使EST數(shù)據(jù)得到快速、有效的分析。該數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)完成了EST序列聚類，載體序列、低質(zhì)量序列和重復序列的去除，EST序列拼接，

4、SNP位點的發(fā)掘，PCR引物的設計和篩選，SNP分子標記定位以及多態(tài)性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）計算。
　　 通過對2018530條玉米EST序列的聚類與拼接發(fā)掘出遍布全基因組的80363個SNP位點。在SNP位點兩側的保守序列上設計PCR引物，開發(fā)出12388個SNP分子標記，包含34721個SNP位點，12762個位點的多態(tài)性信息含量(PIC)大于0.4，具有高度多態(tài)

5、性。其中，6008個標記只含單一的SNP位點。根據(jù)SNP標記所在“B73”自交系基因組BAC序列在染色體上的位置，12117個標記可定位于玉米的10條染色體上，以第1染色體上的標記最多。并基于Microsoft Windows XP操作系統(tǒng)，利用Adobe Dreamweaver等軟件在四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所網(wǎng)站上建立標記公共數(shù)據(jù)庫的靜態(tài)平臺（http://www.sicau.edu.cn/web/yms/snp/snp.html），所

6、有SNP分子標記及相關信息可登錄該網(wǎng)頁查閱。
　　 從所開發(fā)的SNP分子標記中隨機挑選9對標記引物，以46個玉米自交系的為材料，根據(jù)差異核苷酸高分辨率熔解曲線形狀的不同，利用HRM技術對加有飽和熒光染料的實時定量PCR擴增產(chǎn)物進行基因分型來驗證SNP的多態(tài)性。熒光值差異曲線顯示：在有熒光信號的自交系中，9對引物的PCR產(chǎn)物都被HRM分型，表現(xiàn)出多態(tài)性，P5和P6出現(xiàn)兩種基因型，其余引物都顯示出3種基因型，SNP檢測率為100％。

7、熔解峰顯示：對于有信號的自交系，9對引物的PCR產(chǎn)物熔解峰都為單一峰，無非特異性擴增及引物二聚體產(chǎn)生，且峰值相近，說明這些引物的特異性高較好。由于在SNP標記開發(fā)過程中，引物是基于模式自交系“B73”的BAC文庫設計及篩選的，擴增信號的有無可能跟B73與其他自交系在引物結合區(qū)域的核苷酸差異有關。每對引物都有少數(shù)自交系目的條帶沒有被擴增出來，HRM熔解無熒光信號，其中，P4只有“丹340”無信號，P1最多，有14個自交系沒有信號。