基于單核苷酸多態(tài)性的甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2功能性分子標(biāo)記開發(fā)與利用.pdf

1、甜瓜鏈孢菌性枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.Melonis,Fom)是由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.melonis Snyder and Hansen)導(dǎo)致的一種最難控制的土傳病害,成為影響甜瓜品質(zhì)和產(chǎn)量的主要因素。本研究以兩個(gè)厚皮甜瓜(Cucumis melo)品種為實(shí)驗(yàn)材料,分別為美國(guó)甜瓜(Cantaloupe)和仙果027-5(xianguo027-5)。通過(guò)基因克隆和序列比

2、對(duì)獲得3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。在它們的F1與F2代群體中,采用限制性內(nèi)切酶酶切(CAPS)和等位基因特異性PCR(AS-PCR)兩種DNA分子標(biāo)記驗(yàn)證這些單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的有效性和可靠性,進(jìn)而將驗(yàn)證的標(biāo)記轉(zhuǎn)化為功能性分子標(biāo)記,應(yīng)用于常規(guī)品種的篩選。我們克隆得到了Fom-2 LRR區(qū)DNA序列,長(zhǎng)為1311 bp。采用生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)高抗和高感枯萎病材料的第281、1076和1216堿基處存在3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),

3、并且這些堿基的突變導(dǎo)致了相應(yīng)氨基酸的改變。以高抗和高感枯萎病材料雜交得到的F1(30株)與F2(100株)代群體為研究材料,采用限制性內(nèi)切酶酶切方法對(duì)其單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析。篩選得到特異性的擴(kuò)增引物對(duì)CAPS-2F與CAPS-2R,CAPS-3F與CAPS-3R,特異性PCR后經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP2與SNP3兩個(gè)位點(diǎn)在F2群體中純合抗病類型、雜合抗病類型與純合感病類型呈現(xiàn)1∶2∶1的分離比例,符合孟德爾單基因遺傳學(xué)規(guī)

4、律,成功將CAPS標(biāo)記轉(zhuǎn)化為功能性分子標(biāo)記。依據(jù)CAPS方法獲得的結(jié)果,我們?cè)O(shè)計(jì)篩選得到AS-PCR特異性引物2-3F1與2-3R1引物對(duì),在退火溫度為62℃,35個(gè)循環(huán)條件下進(jìn)行特異性PCR,F2群體中抗性材料和感病材料呈現(xiàn)3∶1的孟德爾單基因分離比例。因此CAPS和AS-PCR兩種方法都證明了SNP2與SNP3的有效性與可靠性。采用CAPS與AS-PCR方法對(duì)34份常規(guī)栽培品種進(jìn)行分析,篩選得到2個(gè)純合枯萎病抗病材料和9個(gè)雜合抗病材