TNF-α基因單核苷酸多態(tài)性與肺炎的相關(guān)性研究.pdf

1、肺炎是包括肺泡和間質(zhì)組織在內(nèi)的肺組織感染。肺炎在臨床上相當(dāng)常見，大部分肺炎患者在接受合理抗生素治療后較快地痊愈出院，但臨床上也能見到部分肺炎患者雖然給予足量抗生素，但炎癥反應(yīng)仍不斷進展，嚴(yán)重影響呼吸功能，部分患者需氣管插管、液體復(fù)蘇、血管活性藥物等治療，即這部分患者進展為重癥肺炎。重癥肺炎一般是由于嚴(yán)重的細菌感染所致，因此臨床上十分重視針對細菌的抗感染治療。雖然新的抗生素相繼問世，但是重癥肺炎發(fā)病率和死亡率并沒有明顯下降。隨著基礎(chǔ)和臨床

2、研究的進一步深入，我們認識到重癥肺炎導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)以及多器官功能障礙綜合征是機體防御機制過度激活引起自身破壞的結(jié)果，而不是細菌及其毒性產(chǎn)物直接作用的結(jié)果。 TNF是一類具有炎癥介導(dǎo)與腫瘤細胞毒性作用的細胞因子，由3條相同的多肽鏈組成，形成有活性的三聚體結(jié)構(gòu)。TNF與靶細胞膜上3個TNF受體同時結(jié)合，傳遞級聯(lián)信號。TNF有兩種存在形態(tài)，在合成初期，TNF通過短的跨膜片段與細胞膜相連形成膜蛋白結(jié)構(gòu)，后來經(jīng)金屬蛋白酶降解形成可溶結(jié)

3、構(gòu)。這兩種存在形式都有生物活性，因此，局部的細胞之間可以通過膜上TNF橋接來傳遞信號，也可以通過分泌TNF到細胞外傳遞炎癥信號。幾乎所有體細胞均表達TNF受體，但不同細胞接受TNF信號后的表現(xiàn)可以有很大不同，這取決于細胞種類與細胞所處的狀態(tài)。通常TNF傳遞抗感染信號，能誘導(dǎo)受病毒感染的細胞凋亡，或者經(jīng)LPS誘導(dǎo)血細胞生成和釋放TNF，促進炎癥反應(yīng)清除病原。在另外一些情況，TNF傳遞組織重構(gòu)的信號。例如，表達在血細胞表面的TNF通過直接橋

4、接多個細胞，既可促進淋巴細胞增生，也可促進淋巴細胞凋亡。根據(jù)TNF細胞來源和分子結(jié)構(gòu)不同，可分為TNF-a和TNF-β兩型。TNF-a主要由活化的單核/巨噬細胞產(chǎn)生；TNF-β則主要由激活的T淋巴細胞產(chǎn)生，但二者結(jié)合相同的受體，具有相同的生物學(xué)活性。TNF-a的產(chǎn)生一般是LPS等刺激因子與單核/巨噬細胞的特定受體結(jié)合，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子，啟動下游TNF基因的轉(zhuǎn)錄。TNF-amRNA轉(zhuǎn)錄后，合成TNF-a前體蛋白，并經(jīng)絲氨酸蛋

5、白酶裂解，形成可溶的TNF-a并釋放到細胞外。TNF-a與靶細胞膜表面的TNF受體結(jié)合，激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，活化大量的細胞基因，產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)作用。在肺部炎癥中，TNF-a通過促進中性粒細胞表面細胞黏附分子CD11/18表達及氧自由基釋放，介導(dǎo)粒細胞在心肺循環(huán)中黏附于肺內(nèi)毛細血管內(nèi)皮上，損傷血管內(nèi)皮。TNF-a能夠誘導(dǎo)多種細胞合成和向胞外分泌PLA2，實驗證明PLA2能催化膜磷脂生成溶血性磷脂酰膽堿、花生四烯酸、血小板活化因子、白細

6、胞三烯及各種前列腺素等強效致炎因子，進一步加重炎癥引起的肺組織損傷。給予單克隆抗體中和肺循環(huán)中游離的TNF-a，豬肺內(nèi)水腫和炎細胞浸潤狀況有明顯改善。 既然TNF-a與炎癥密切相關(guān)，那么TNF-a基因的突變就是否會影響。TNF-a的轉(zhuǎn)錄與表達，或者引起嚴(yán)重的肺部感染，甚至發(fā)展為膿毒癥，增加重癥肺炎的發(fā)病率與膿毒癥的死亡率呢?在TNF-a啟動子區(qū)離轉(zhuǎn)錄起始位點上游308個核甘酸處，一般有1個鳥嘌呤(G)位點，人群中第6號染色體大約

7、80％在這個位點是鳥嘌呤，而在20％的人群以腺苷酸代替了G。因為每個個體有2個拷貝的第6號染色單體，因此，每個個體的基因型可分為GG、GA、AA，其相應(yīng)的頻率大約為68％～80％、15％～25％、2％～5％。由于TNF-a-308A的轉(zhuǎn)錄活性高于TNF-a-308G，在接受相同量LPS刺激，攜帶TNF-a-308A等位基因者的TNF-a產(chǎn)生量較多。Mira的研究表明，帶有TNF-a-308A等位基因的人群易罹患膿毒性休克。臺灣有研究指出

8、，帶有TNF-a-308A等位基因并不代表較高的膿毒性休克發(fā)病率，而是當(dāng)膿毒性休克發(fā)生后，TNF-a-308A導(dǎo)致更高的死亡率[2]。國外一項多中心研究探討了TNF-a-308A與膿毒癥的關(guān)系，攜帶TNF-a-308A的膿毒性休克患者有68％出現(xiàn)血漿TNF-a濃度升高，而攜帶TNF-a-308G的患者有53％出現(xiàn)TNF-a濃度升高，但二者濃度水平無明顯差異。然而，TNF-a-308A死亡率明顯較TNF-a-308G組高。通過分析發(fā)現(xiàn)，T

9、NF-a-308A將死亡率升高了約3.75倍。在此研究中也檢查了其他突變位點，但未發(fā)現(xiàn)與病情相關(guān)。Khalil的研究也得出相同的結(jié)果，認為TNF-a-308A增加了死亡率。TNF-a基因其他位點也發(fā)現(xiàn)與炎癥相關(guān)。在包含98例特發(fā)性急性前葡萄膜炎與354名志愿者的研究中，70％的患者攜帶TNF-a-857CC，28％攜帶TNF-a-857T，85.6％志愿者攜帶TNF-a-857CC，51％攜帶TNF-a-857T，等位基因在患者與志愿者

10、間的分布的分布有顯著性差異。TNF-a與術(shù)后感染也有關(guān)系，197名食管癌手術(shù)患者中55名出現(xiàn)術(shù)后感染，發(fā)現(xiàn)TNF-a-308A與感染并發(fā)癥有關(guān)，實驗中也發(fā)現(xiàn)了-238、-863、-857等位點的突變，但與術(shù)后感染并發(fā)癥無關(guān)。雖然在研究人員認為TNF-a-308A與TNF-a的高表達有關(guān)，但是也有相關(guān)研究認為TNF-a-308A不影響TNF-a的表達，而TNF-a-g63A似乎還降低了TNF-a的表達。TNF-a-308G/A與TNF-a

11、-238G/A是否存在突變與AECOPD發(fā)生與否無關(guān)，而Stuber對80例膿毒癥病人的研究也發(fā)現(xiàn)，TNF-a-308A與嚴(yán)重感染的易感性無關(guān)聯(lián)。 本研究擬通過PCR-PFLP法及測序檢測。TNF-a啟動子區(qū)5個SNPs(TNF-a-1031、-863、-857、-308與-238)在肺炎及健康人群中的分布，通過ELISA方法檢測研究對象血漿TNF-a濃度，再結(jié)合肺炎患者病情，探討SNPs與肺炎發(fā)病及病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為進一

12、步進行重癥肺炎發(fā)病機制的研究、重癥肺炎的早期干預(yù)及重癥肺炎預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。 方法： 1、收集2006年11月至2007年6月就診于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院的67例成年肺炎患者及50例健康體驗者，抽取外周血，提取白細胞基因組DNA，根據(jù)TNF-a啟動子區(qū)5個SNPs設(shè)計5對引物，PCR擴增目的片段。 2、根據(jù)酶切位點選擇相應(yīng)限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行酶切，并根據(jù)酶產(chǎn)物長度判斷多態(tài)性位點的存在。 3、選擇突

13、變DNA樣本重新擴增后進行測序，確定突變位點確定存在。 4、分離外周血血清，通過ELISA方法檢測TNF-a濃度。 5、收集肺炎患者住院天數(shù)、血白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)與死亡率等數(shù)據(jù)，并分析以上資料與SNPs的關(guān)系。 結(jié)果： 1、TNF-a啟動子基因突變位點的分布在肺炎患者中，除TNF-a-238G外，其余位點均存在突變，其中，TNF-a-1031T/C發(fā)現(xiàn)17例雜合子，4例純合子，TNF-a-863C

14、/A發(fā)現(xiàn)11例雜合子，2例純合子，TNF-a-857C/T發(fā)現(xiàn)7例雜合子，1例純合子，TNF-a-308G/A發(fā)現(xiàn)11例雜合子，未發(fā)現(xiàn)純合子。在健康對照組中，TNF-a-1031T/C發(fā)現(xiàn)12例雜合子，未發(fā)現(xiàn)純合子，TNF-a-863C/A發(fā)現(xiàn)4例雜合子，2例純合子，TNF-a-857C/T發(fā)現(xiàn)4例雜合子，未發(fā)現(xiàn)純合子，TNF-a-308G/A發(fā)現(xiàn)3例雜合子，未發(fā)現(xiàn)純合子，TNF-a-238G/A僅發(fā)現(xiàn)1例雜合子，與肺炎組比較，其分布無

15、統(tǒng)計學(xué)差異。 2、TNF-a啟動子SNPs與肺炎臨床特征的相關(guān)性在重癥肺炎患者中，除TNF-a-238G外，其余位點均存在突變，其中，TNF-a-863C/A突變在重癥肺炎組分布為野生型5例，突變型4例，在非重癥肺炎組的分布為野生型49例，突變型9例，其分布具統(tǒng)計學(xué)差異。TNF-a-308G/A的突變在重癥肺炎組分布為野生型5例，突變型4例，在非重癥肺炎組的分布為野生型51例，突變型7例，其分布具統(tǒng)計學(xué)差異。另外，TNF-a-3

16、08G/A突變在死亡病例中的分布為野生型1例，突變型3例，在存活病例中的分布為野生型55例，突變型8例，其分布具統(tǒng)計學(xué)差異。同時，在肺炎患者中，TNF-a-308G/A突變組與野生組相比，外周血白細胞、中性粒細胞計數(shù)的差別有統(tǒng)計學(xué)差異。 3、肺炎組與健康對照組相比，血漿TNF-a濃度較高(71.407±46.728pg/mLvs.4.642±3.979pg/mL)，具統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000)；非重癥肺炎組與重癥肺炎組相比(6

17、9.892±47.027pg/mLvs.81.176±46.267pg/mL)則無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.505)。各SNPs突變組與野生型組比較，血漿TNF-a濃度無顯著性差異。 結(jié)論： 本研究通過PCR-PFLP方法檢測67名肺炎患者及50名健康體檢者TNF-a啟動子區(qū)其中5個SNPs(TNF-a-1031、-863、-857、-308、-238)的分布，發(fā)現(xiàn)TNF-a-238A在中國漢族人群中的分布稀少，單個SNP在肺