SOD單核苷酸多態(tài)性與噪聲性聽力損失的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、隨著物質(zhì)文明的進(jìn)步，工業(yè)、交通和生活的現(xiàn)代化，噪聲(noise)污染日益嚴(yán)重，尤其是工業(yè)噪聲。噪聲對(duì)機(jī)體特異性的影響表現(xiàn)為長(zhǎng)期高強(qiáng)度暴露引起噪聲性聽力損失(noise induced hearing loss，NIHL)。NIHL是目前最主要的職業(yè)危害之一，美國(guó)約有1000萬(wàn)人口的永久不可逆性聽力損失是由噪聲和外傷引起的，我國(guó)噪聲暴露人群中NIHL的患病率高達(dá)20％以上，如何預(yù)防和控制職業(yè)性噪聲危害，減少NIHL的發(fā)生已成為我國(guó)乃至世界

2、職業(yè)衛(wèi)生研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。 研究目的： 1.探討中國(guó)漢族人群SOD1、SOD2以及存在的SNPs和單倍型與NIHL易感性之間的關(guān)聯(lián)； 2.探討SOD1、SOD2、噪聲暴露之間，基因與基因的交互作用以及基因與環(huán)境的交互作用對(duì)NIHL易感性的影響； 3.探討SOD1、SOD2 SNPs對(duì)SOD1、SOD2酶活力，總抗氧化能力，脂質(zhì)過氧化水平，聽閾位移的影響，初步解釋SOD1、SOD2 SNPs與NIHL易

3、感性存在關(guān)聯(lián)的作用機(jī)制； 4.尋找適用于中國(guó)漢族人群的NIHL易感性分子標(biāo)志物。 研究方法： 1.易感人群和耐受人群的識(shí)別和確認(rèn) 1.1選擇廣州市某大型空調(diào)生產(chǎn)企業(yè)連續(xù)性噪聲暴露強(qiáng)度在75～120dB范圍內(nèi)2400名作業(yè)工人為研究對(duì)象，以統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)納入研究范圍。參照我國(guó)《職業(yè)性聽力損失診斷標(biāo)準(zhǔn)》(GBZ49-2002)的要求對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行左、右耳500～6000Hz內(nèi)6個(gè)頻率的純音氣導(dǎo)聽閾測(cè)試和耳科檢

4、查。并對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)問卷調(diào)查。 1.2根據(jù)《工作場(chǎng)所物理因素測(cè)量-噪聲》(GBZ/T189.8-2007)，使用ND2型精密聲級(jí)計(jì)檢測(cè)所有研究對(duì)象作業(yè)環(huán)境中噪聲暴露強(qiáng)度。并對(duì)可能影響聽力系統(tǒng)的職業(yè)危害因素進(jìn)行識(shí)別。 1.3以左耳3000Hz頻段聽閾位移作為衡量聽力水平的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)噪聲檢測(cè)結(jié)果劃分不同噪聲強(qiáng)度暴露強(qiáng)度組，比較同一噪聲暴露強(qiáng)度組內(nèi)噪聲作業(yè)人員的左耳3000Hz頻段聽閾位移情況，篩選出聽閾位移最大的10

5、％個(gè)體作為本研究的易感人群，聽閾位移最小的10％個(gè)體作為本研究的耐受人群。 2.SNPs位點(diǎn)的選擇以及相關(guān)引物探針的設(shè)計(jì) 通過查閱dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www．ncbi．nlm．nikgov/SNP)；GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/Genebank)；國(guó)際單倍型圖譜計(jì)劃(http：//www．hapmap．org)；美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(http：//www．a(chǎn)

6、pplied bio systems．com)軟件SNP瀏覽器，確定候選SNPs。應(yīng)用Primer Primier軟件(http：//www．a(chǎn)pplied biosysterns．com)設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的引物序列和TaqMan探針序列，通過Blast進(jìn)行同源性比較后，選擇同源性最小，Tm最合適的序列，委托美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司進(jìn)行合成。 3.SOD SNPs與NIHL易感性的關(guān)聯(lián) 利用EDTA抗凝管采集易感人群和耐受

7、人群空腹靜脈血樣5ml/人，立即分離血漿和血細(xì)胞，血細(xì)胞用于抽提基因組DNA；血漿用于檢測(cè)抗氧化酶活力和脂質(zhì)過氧化水平。采用TaKaRa公司基因組抽提試劑盒抽提外周血細(xì)胞DNA并鑒定DNA的濃度和純度，采用TaqMan探針法進(jìn)行等位基因鑒別，總反應(yīng)體系為25μl；擴(kuò)增過程為95℃預(yù)變性10min，92℃變性15s，60℃退火/延伸1min,40個(gè)循環(huán)。利用Haploview軟件和SAS軟件進(jìn)行遺傳平衡性檢驗(yàn)以及單倍型的計(jì)算和構(gòu)建。

8、 4.SOD SNPs對(duì)SOD1、SOD2、T-AOC以及MDA水平的影響 利用黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現(xiàn)紫紅色，用分光光度計(jì)測(cè)其吸光度的方法檢測(cè)SOD1、SOD2活力(分型SOD1、SOD2活力測(cè)定試劑盒)；利用MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在波長(zhǎng)532nm處比色定量測(cè)定MDA水平(MDA測(cè)定試劑盒)；利用抗氧化能力能使Fe3+還原成Fe2+，

9、后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固絡(luò)合物，通過比色檢測(cè)抗氧化能力水平(T-AOC試劑盒)。 5.統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05。兩組間計(jì)量資料根據(jù)分布情況比較采用f檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較根據(jù)分布情況采用方差分析或秩和檢驗(yàn)，進(jìn)一步進(jìn)行多重線性回歸校正混雜因素的影響；兩組間或多組間計(jì)數(shù)資料比較采用x2檢驗(yàn)或單因素logistic回歸分析，進(jìn)一步利用多因素非條件Lo

10、gistic回歸模型校正混雜因素的影響。兩變量間相關(guān)關(guān)系采用Pearson線性相關(guān)分析，交互作用采用多因素非條件Logistic回歸模型和分層方法進(jìn)行分析。 研究結(jié)果： 1.易感人群和耐受人群的識(shí)別和確認(rèn)　　2.SNPs位點(diǎn)的選擇以及相關(guān)引物和探針的設(shè)計(jì)本研究確定SOD1基因rs 1041740、rs2070424、rsl0032782、rs4998557，SOD2基因rs2842980、rs 5746136、rs27

11、5833 1、rs4880、rs5746092為候選SNPs。其中所選的SOD1基因4個(gè)SNPs均位于內(nèi)含子區(qū)域；SOD2基因5個(gè)SNPs中，rs2758331位于內(nèi)含子區(qū)域，rs5746136位于5’端非翻譯區(qū)，rs5746092位于3’端非翻譯區(qū)，rs4880為錯(cuò)義突變，rs2842980位于基因的近3’端。等位基因探針5’端分別用報(bào)告基團(tuán)VIC和FAM標(biāo)記，3’端加入淬滅基團(tuán)。 3.SOD SNPs與NIHL易感性的關(guān)聯(lián)

12、 4.SOD SNPs對(duì)SOD1、SOD2、T-AOC以及MDA水平的影響 結(jié)論： 在中國(guó)漢族人群中： 1、SOD1rs2040724位點(diǎn)攜帶G等位基因，rs10432782位點(diǎn)攜帶G等位基因，SOD2rs4880位點(diǎn)攜帶C等位基因是NIHL的危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步的基因型與NIHL易感性關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，rs2040724AA基因型是NIHL的保護(hù)因素，rs10432782 GG基因型和rs4880CT基因型是NI

13、HL的危險(xiǎn)因素。 2、SOD1單倍型和SOD2單倍型與NIHL的易感性有關(guān)，與分布頻率最高的SOD1單倍型CGGA相比，單倍型TATG、TGTA、CAGA是NIHL的保護(hù)因素，單倍型CATG是NIHL的危險(xiǎn)因素，與分布頻率最高的SOD2單倍型AGCTG相比，單倍型TACTC是NIHL的危險(xiǎn)因素，單倍型TGCTG是NIHL的保護(hù)因素。 3、SOD1(rs2040724、rs10432782)、SOD2(rs4880)、噪

14、聲暴露(噪聲暴露強(qiáng)度和累積噪聲暴露量)三者對(duì)NIHL易感性影響存在交互作用。較高的噪聲暴露強(qiáng)調(diào)和CNE可增加攜帶SOD1以及SOD2易感基因型個(gè)體患NIHL的風(fēng)險(xiǎn)。 4、SOD1、SOD2 SNPs對(duì)抗氧化酶水平以及脂質(zhì)過氧化水平的影響可部分解釋SOD1、SOD2 SNPs與NIHL易感性的關(guān)聯(lián)機(jī)制。 5、初步認(rèn)為SOD1、SOD2是NIHL的易感基因，SOD1rs2040724和rs10432782SNP，SOD2 r