線粒體DNA COX基因單核苷酸多態(tài)性與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、目的：胃癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率較高，晚期預(yù)后差，嚴(yán)重危害了人類(lèi)的生命健康。近年來(lái)，關(guān)于線粒體DNA突變及其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)與腫瘤生成的研究備受關(guān)注。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是細(xì)胞核外唯一的遺傳物質(zhì)，編碼參與氧化磷酸化和ATP生成所需要的多肽，由于本身缺乏組蛋白的保護(hù)、缺少有效的基因修復(fù)系統(tǒng)等原因，相比于核

2、基因組，mtDNA更易于受到氧化損傷而致突變。mtDNA由編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分組成，其編碼區(qū)包含13種多肽編碼基因、2種rRNA基因和22種tRNA基因，而D-Loop區(qū)是mtDNA的唯一非編碼區(qū)。COX基因作為mtDNA編碼區(qū)的基因之一，其編碼產(chǎn)物（COXⅠ-Ⅲ亞基）是細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome oxidase, COX）的重要組成部分。細(xì)胞色素氧化酶是線粒體呼吸鏈傳遞中的關(guān)鍵酶，其編碼基因的突變和多態(tài)性可能與腫瘤發(fā)生相關(guān)

3、。本研究通過(guò)對(duì)胃癌患者及正常人群的COX基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與胃癌發(fā)病相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，然后將這些位點(diǎn)SNPs與患者臨床特征進(jìn)行對(duì)比分析，以探究COX基因SNPs與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為胃癌的早期診斷和治療提供新思路。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象及標(biāo)本采集：
　　病例組為100例胃癌患者，均為2007年5月-2008年8月于河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院外三科行根治術(shù)的病人，所有患者手術(shù)前均行胃鏡檢查、咬取組織

4、送病理化驗(yàn)診斷為胃癌。對(duì)照組為2013年9月-2014年6月期間在河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院體檢的100例健康人。分別留取胃癌患者及正常人的外周靜脈血標(biāo)本3ml，觀察并記錄胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小等臨床特征，同時(shí)全面記錄對(duì)照組人群的體檢資料。
　　2.線粒體DNA提?。菏褂肈NA提取試劑盒分別提取胃癌患者及正常對(duì)照組人群外周靜脈血的線粒體DNA，經(jīng)DNA定量檢測(cè)合格后，置于零下20℃冰箱中長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?br>　　3.線粒體D

5、NA COX基因的擴(kuò)增及測(cè)序：通過(guò)查閱文獻(xiàn)得知COX基因包括COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ三段基因，我們把整個(gè)COX基因按約600bps大小分成9個(gè)小基因片段(見(jiàn)Table2)，然后給每段基因片段設(shè)計(jì)上下游引物，之后再采用PCR技術(shù)對(duì)每段基因片段進(jìn)行DNA擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物首先經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，然后采用凝膠成像系統(tǒng)檢驗(yàn)DNA條帶擴(kuò)增情況，若DNA條帶擴(kuò)增良好，將該樣品送至生物科技有限公司（北京）進(jìn)行測(cè)序。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析：對(duì)

6、于計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較；對(duì)于計(jì)量資料，當(dāng)n<30例時(shí)采用t檢驗(yàn)，n≥30例采用u檢驗(yàn)。采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.胃癌組的年齡、性別與正常對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明兩組資料均衡可比。
　　2.在胃癌組及對(duì)照組中隨機(jī)選出28例標(biāo)本DNA進(jìn)行整段COX基因的擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)6392T/C、6455C/T、6962G/A、

7、7196C/A、7853G/A、9540T/C、9548G/A、9824T/C、9950T/C9個(gè)高頻率多態(tài)性位點(diǎn)（出現(xiàn)頻率>5％）。將以上9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的分布頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，可以看出胃癌組9540T/C位點(diǎn)的SNPs分布頻率相比于對(duì)照組有臨界性差異(χ2=3.541， P=0.06)，同時(shí)9548G/A位點(diǎn)在病例組與對(duì)照組間的分布頻率（χ2=1.409， P=0.235）也可能具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這兩個(gè)位點(diǎn)的SNPs分布頻率可能與胃

8、癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。
　　3.將9540T/C及9548G/A所屬基因片段的病例數(shù)增加至100例，發(fā)現(xiàn)9540T/C位點(diǎn)的SNPs與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.504， P=0.034），另外發(fā)現(xiàn)9548G/A位點(diǎn)SNPs在病例組和正常對(duì)照組間的分布頻率同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=4.188，P=0.041）。
　　4.分別將9540T/C、9548G/A兩個(gè)位點(diǎn)SNPs分布頻率和胃癌患者的臨床特征進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，

9、這兩個(gè)位點(diǎn)SNPs與胃癌患者臨床特征，包括年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑、腫瘤分化程度、腫瘤分期、脈管瘤栓及神經(jīng)受侵等均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.mtDNA編碼區(qū)COX基因上的9540T/C、9548G/A兩個(gè)位點(diǎn)SNPs與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，9540C基因型可能降低了胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而9548A基因型可能增加了胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　2.COX基因的9540T/C、9548G/A兩位點(diǎn)的SNPs與胃癌患者臨床特征