β防御素1基因單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景:膿毒癥(sepsis)系微生物入侵機(jī)體感染后所致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),機(jī)體促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)間的不平衡及免疫功能的失調(diào)和凝血纖溶系統(tǒng)的異常是其發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎(chǔ).重癥膿毒癥(severe sepsis)、膿毒性休克(septic shock)及多器官功能障礙綜合征(multiple organdysfunction synd

2、rome,MODS)是膿毒癥的后續(xù)癥.膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)中高發(fā)及高致死率的主要疾病,它是一種環(huán)境因素(病源微生物)和遺傳因素共同作用的多基因病,多個(gè)常見的、微效的遺傳變異獨(dú)立或相互間通過(guò)目前尚未能闡明的分子機(jī)制在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用,不同個(gè)體對(duì)膿毒癥的易感性和預(yù)后存在明顯的差異,這種個(gè)體間的基因背景差異和基因多態(tài)性,影響了個(gè)體對(duì)感染及創(chuàng)傷所致的系統(tǒng)性炎癥應(yīng)答反應(yīng).基因決定著各種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的合成和釋放,以

3、往的研究提示編碼炎癥介質(zhì)和纖溶凝血分子基因的多態(tài)性可能是膿毒癥及MODS的高危預(yù)警標(biāo)識(shí).天然免疫系統(tǒng)在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,在人呼吸道上皮中具有天然免疫活性的陽(yáng)離子多肽分子主要是人β防御素(human beta,defensin,DEFB)和LL-37.DEFB是一類具有抗菌活性的陽(yáng)離子多肽,它具有廣譜的抗微生物活性的同時(shí)又具有某些免疫調(diào)節(jié)作用,如對(duì)樹突狀細(xì)胞及T細(xì)胞有趨化作用.DEFB1是最早發(fā)現(xiàn)的DEFB,研究發(fā)現(xiàn)DEF

4、B1在皮膚及多種上皮組織中均有表達(dá),它在呼吸道黏膜的抗微生物過(guò)程中起著重要作用.DEFB1的基因定位于8號(hào)染色體,p23區(qū),在對(duì)五類人種DEFB1基因的研究中共發(fā)現(xiàn)了15個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs),其中7個(gè)SNP在不同人種中等位基因頻率存在明顯差異.盡管DEFBl是組成型表達(dá)的,但已有研究表明DEFB1基因中SNP與某些疾病存在相關(guān)性,5'非編碼區(qū)的SNP與兒童HIV病毒

5、感染、哮喘和遺傳性過(guò)敏癥存在相關(guān)性,而-44C/G可能與口腔黏膜假絲單胞菌感染關(guān)聯(lián),1654A/G是一個(gè)第二外顯子非同義突變,曾報(bào)道日本COPD患者中等位基因G的頻率高達(dá)8﹪,但DEFB1基因多態(tài)性是否與膿毒癥的發(fā)生和預(yù)后存在相關(guān)性,至今仍無(wú)相關(guān)報(bào)道. 研究目的: 通過(guò)病例一對(duì)照關(guān)聯(lián)研究,探討DEFB1基因單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥的易感性、肺損傷的嚴(yán)重程度及預(yù)后是否存在相關(guān)性,進(jìn)而尋找有效的膿毒癥相關(guān)基因標(biāo)識(shí). 方

6、法:本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者知情同意后,由本人或直系親屬簽字后進(jìn)行. 膿毒癥患者268例,均符合1992年和2001年美國(guó)胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)及危重病學(xué)會(huì)制定的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的病人,排除孕婦及年齡小于18歲的患者.疾病嚴(yán)重程度采用急性生理學(xué)及慢性健康評(píng)分(APACHEⅡ)和膿毒癥相關(guān)器官衰竭評(píng)分(Sepsis-related Organ FailureAssessment Score)(SOFA),呼吸系統(tǒng)損傷程度以氧合指數(shù)(O

7、I)表示.對(duì)照組157例,為同期擇期手術(shù)后未并發(fā)膿毒癥的病人. 抽取外周靜脈血10ml,以2﹪乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝,移取200 μl全血用QIAamp DNA B100d Mini Kit(QIAGEN公司)提取基因組DNA.將提取的基因組DNA溶于200μ l TE緩沖液中置-80℃冰箱保存. 聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段及DNA直接測(cè)序-1816A/G(rs2741136)、-52A/G(rsl7

8、99946)、-44C/G(rs1800972)、-20A/G(rs11362)的測(cè)定采用PCR擴(kuò)增DNA片段后DNA直接測(cè)序的方法.隨機(jī)抽取30例標(biāo)本,采用限制性酶切分析驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)雙引物等位基因特異性擴(kuò)增法(PCR-ASA)-390A/T (rs2738182)檢測(cè)采用PCR-ASA的方法,分別設(shè)計(jì)兩條上游引物,引物的3'端首個(gè)堿基恰好分別結(jié)合-390A/T多態(tài)位點(diǎn)的A和T,其余序列相同,同時(shí)設(shè)計(jì)兩條不

9、同的下游引物.每一標(biāo)本均用兩對(duì)引物分別擴(kuò)增,將兩次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物混合勻后抽取8μl于2﹪瓊脂糖凝膠(0/25μg/ml溴化乙錠)電泳(90V,40min),置于紫外成像儀下分析:A/A純合在408bp處呈現(xiàn)一條亮帶,A/T雜合分別在408bp、263bp處有兩條亮帶,T/T純合在263bp處呈現(xiàn)一條亮帶,隨機(jī)抽取30個(gè)標(biāo)本進(jìn)行直接測(cè)序,兩種檢測(cè)結(jié)果均吻合. TaqMan檢測(cè)SNP 1654G/A(rs2738047)采用TaqM

10、an檢測(cè)其基因型,引物、探針及檢測(cè)設(shè)備由上?；瞪锕咎峁?熒光基團(tuán)FAM和VIC分別標(biāo)記野生型等位基因A和突變等位基因G,淬滅基團(tuán)均為TAMRA.隨機(jī)抽取30個(gè)標(biāo)本進(jìn)行直接測(cè)序,兩種檢測(cè)結(jié)果均吻合. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組中每個(gè)SNP均采用x<'2>進(jìn)行Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn),各組間基因型和等位基因頻率比較采用x<'2>檢驗(yàn)及Fisher's Exact檢驗(yàn);等位基因的風(fēng)險(xiǎn)概率以比值比(OR)和95﹪可信區(qū)間

11、(95﹪CI)表示;APACHBⅡ、SOFA評(píng)分和OI的組間比較采用Kmskal Wallis非參秩和檢驗(yàn).P<0.05認(rèn)為有顯著性差異. 結(jié)果: 1、膿毒癥組和對(duì)照組均為漢族人種,兩組間的性別構(gòu)成和年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05). 2、各組中SNPs的Hardy-Weinberg(H-W)平衡經(jīng)x<'2>檢驗(yàn)P值均大于0.05,符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡. 3、-44C/G(rs1

12、800972)和-20MG(rs11362)的三種基因型的構(gòu)成比及等位基因頻率在膿毒癥組和對(duì)照組中均存在顯著性差異(P<0.05),在膿毒癥組-44C/G位點(diǎn)G的頻率較高(15.86﹪),而對(duì)照組僅為8.60﹪,OR為2.00(1.27-3.17);-20A/G位點(diǎn)G的頻率較之對(duì)照組高,分別為64.93﹪和55.73﹪,OR為1.47(1.11-1.96).其余4個(gè)SNPs基因型的構(gòu)成比及等位基因頻率在膿毒癥組和對(duì)照組中均無(wú)顯著性差異(

13、P>0.05),其中1654G/A中等位基因A的頻率為0. 4、死亡組中-44C/G位點(diǎn)G的頻率較高為22.13﹪,而在存活組中僅為8.43﹪,差異有顯著性;另一SNP-1816A/G位點(diǎn)中等位基因G的頻率在死亡組和存活組中分別為21.31﹪、10.48﹪,同樣存在顯著差異(P<0.05).其余SNPs中等位基因頻率在死亡和存活兩組中無(wú)顯著性差異(P>0.05). 5、膿毒癥患者-1816A/G位點(diǎn)G/G純合子的氧合指數(shù)

14、較A/G、A/A的氧合指數(shù)有顯著性降低(P<0.05),而APACHEⅡ和SOFA評(píng)分在各基因型中無(wú)顯著性差異. 結(jié)論： 本研究首次報(bào)道漢族人群中DEFB1基因單核苷酸多態(tài)與膿毒癥的相關(guān)性.我們發(fā)現(xiàn)-44C/G(rs1800972)、-20A/G(rs11362)與膿毒癥的易感性相關(guān),而-44C/G(rs1800972)、-1816A/G(rs2741136)與膿毒癥的預(yù)后存在關(guān)聯(lián),-1816A/G(rs2741136)