基于轉錄組數(shù)據(jù)的鮸魚分子標記篩選及基因差異表達分析.pdf

1、鮸魚，屬于石首魚科，是漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中一種重要的海洋經(jīng)濟魚類。目前由于病原菌和寄生蟲引起的疾病使鮸魚的大規(guī)模養(yǎng)殖受到限制，大大降低了鮸魚的產(chǎn)量和經(jīng)濟價值。鮸魚轉錄組和基因組信息的缺乏限制了研究人員對鮸魚的發(fā)病機制和免疫系統(tǒng)的研究。本文中，我們首先構建了健康鮸魚的肝臟、脾臟和腎臟的cDNA文庫并使用Illumina公司雙末端測序方法測序，用于鮸魚功能基因的發(fā)掘和分子標記的開發(fā)。為了了解鮸魚感染哈維氏弧菌后的免疫機制和獲得大量高表達的免疫

2、基因，我們分別對健康的鮸魚脾臟(Ctrl)和感染哈維氏弧菌的鮸魚脾臟(Vha)進行了轉錄組測序。在本研究中，通過兩次鮸魚轉錄組測序分析，我們獲得的主要結論如下：
　　1.我們利用Illumina HiSeq2000高通量技術平臺對鮸魚肝臟、脾臟和腎臟進行轉錄組測序。通過篩選掉低質量的raw reads我們共獲得了25,760,602條clean reads，組裝得到69,071條unigenes。采用BLAST相似性比對方法把這些

3、序列比對NT, NR, Swiss-Prot和 KEGG數(shù)據(jù)庫，共有45,676條 unigenes得到了注釋。有8,423個unigenes獲得了GO注釋并分類到51個功能類別中，有21,662個unigenes被歸納到COG的25個功能分類，共有23,927條獲得了KEGG注釋，共參與123條代謝通路中。根據(jù)這些注釋，我們篩選得到了498個免疫相關基因，并根據(jù)功能分成了14類。
　　2.經(jīng)過篩選，我們在11,251條unige

4、nes中共獲得了14,885條SSR位點，其中雙堿基重復類型最多。從設計的87對引物中共篩選出58對微衛(wèi)星引物，其中25條為多態(tài)性微衛(wèi)星標記。這些位點的等位基因數(shù)為2-9，平均等位基因數(shù)為3.88。觀測雜合度(Ho)為0.100-1.00，平均值為0.433；期望雜合度(He)為0.095-0.784，平均值為0.489。PIC值為0.005-0.991，平均PIC值為0.49。另外，我們還檢索到了8,510個預測的單核苷酸多態(tài)性位點，

5、其中包括6,182個轉換和2,328個顛換。
　　3.通過對鮸魚感染哈維氏弧菌前后脾臟的轉錄組測序，我們分別獲得50,339,252條 reads和50,661,542條 reads。通過與基因組比對篩選后，共得到37,410,818條clean reads，組裝得到78,176條unigenes，并進行了生物信息學分析。
　　4.通過對這兩組樣本進行表達定量分析，共有41,845個基因在Ctrl樣品中表達，有41,989個

6、基因在Vha樣品中表達。共獲得1,350個顯著性差異表達的基因，其中上調的有782個，下調的有568個，并進行了差異表達基因的GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。
　　5.依據(jù)差異表達基因的 GO富集分析和 KEGG信號通路富集分析，篩選獲得大量的免疫相關基因及其在哈維氏弧菌感染后的調控機制。如免疫球蛋白I gM、I gD和IgA，趨化因子及受體CCL19、CCL21、CCL25、CXCR3和CXCR7，以及補體C1Q、C