鮸魚(Miichthys miiuy)自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子(Natural killer enhancing factor, NKEF)于1993年在人類的紅細(xì)胞中被分離純化，成為了Peroxiredoxin(Prx)抗氧化蛋白家族一個(gè)重要的成員。因?yàn)樵隗w外可以增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，所以被命名為自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子。為了研究硬骨魚中NKEF的免疫防御機(jī)制，在本篇論文中，我們采用快速擴(kuò)增cDNA末端(rapid amplification of cDNA e

2、nds，RACE)的方法，經(jīng)過(guò)凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆子的檢測(cè)和測(cè)序后，得到鮸魚NKEF-A全長(zhǎng)cDNA序列。鮸魚NKEF-A cDNA全長(zhǎng)為1235bp，其中包括47bp的5'非翻譯區(qū)，597bp的開放閱讀框和591bp的3'非翻譯區(qū)，整個(gè)開放閱讀框編碼198個(gè)氨基酸。鮸魚NKEF-A的蛋白分子量約為23kDa，在其蛋白質(zhì)序列中，含有三個(gè)半胱氨酸殘基(Cys)，其中第52位和173位上的半胱氨酸殘基分別存在于兩個(gè)高度保守的VCP

3、信號(hào)上，通過(guò)比對(duì)其他幾種I類抗氧化蛋白家族成員后，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位置的半胱氨酸殘基也是非常保守的，并且是Prx家族蛋白發(fā)揮其生物學(xué)功能的氨基酸區(qū)域。熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析后表明，NKEF-A基因在鮸魚十個(gè)正常組織中普遍表達(dá)，但是表達(dá)水平有著明顯的差異。在不同時(shí)間段鰻弧菌感染的肝組織、脾組織和腎組織中，NKEF-A的表達(dá)水平均有所上調(diào)。最后，我們構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-NKEF質(zhì)粒，誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá)，確定最佳的誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)濃度，純化了重