鰻弧菌感染相關的鮸魚差異表達基因的miRNA調(diào)控研究.pdf

1、在長期的進化進程中，為抵抗病原生物進化出免疫系統(tǒng)。脊椎動物的免疫系統(tǒng)分為先天性免疫系統(tǒng)(Innate immunity)和獲得性免疫系統(tǒng)(Acquired immunity)。Toll/IL-1受體超家族(Toll/IL-1 receptor superfamily)是由TLR家族和IL-1R家族組成。這個新受體家族中的成員都含有Toll同源結(jié)構(gòu)域的TH結(jié)構(gòu)域，是由含有128個氨基酸殘基的10段保守序列組成的。這一信號通路成員是重要的模

2、式識別受體，在對抗外來入侵病原體的天然免疫中發(fā)揮著重要的作用。MicroRNA(miRNA)是約含22核苷酸的內(nèi)生非編碼的小分子RNA，作為一類負轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后水平。miRNA可以通過特定的結(jié)合位點與mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)通過不完全的互補配對方式引起該基因翻譯受阻或者直接降解mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。在本研究中，通過鮸魚轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得病原菌感染后的差異表達基因，并對差異表達的Toll/

3、IL-1受體超家族中成員進行了miRNA調(diào)控研究，研究結(jié)論如下:
　　1.我們通過對鮸魚感染鰻弧菌前后的脾臟cDNA進行轉(zhuǎn)錄組測序，對照組(Ctrl)獲得51，853，370條raw reads和感染組(Van)獲得51，852，199條raw reads。通過與鮸魚參考基因組序列進行比對篩選，對照組獲得34，790，143條匹配的read，Van感染組獲得34，526，606條匹配的reads，這些read組裝成了47，971條

4、unigenes。然后，對兩組樣本進行數(shù)字表達譜分析，獲得差異表達的基因2，482個，其中上調(diào)的有1，313個。然后，根據(jù)這些差異表達基因的GO功能富集分析及KEGG信號通路富集分析，獲得了一些與病原體感染后免疫相關的基因，其中包括Toll/IL-1受體家族的TLR1和IL-1R等，它們都是在鰻弧菌感染下表達量發(fā)生顯著上調(diào)的基因。
　　2.本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1RI在鰻弧菌感染的鮸魚脾臟組織及LPS刺激的鮸魚巨噬細胞中的表達量都是顯

5、著升高的，進一步證實了IL-1RI在免疫及炎癥反應中發(fā)揮作用。利用生物學信息學的方法，篩選出了可能與IL-1 RI3'UTR區(qū)域結(jié)合的miRNA，其中包括miR-192，并對其啟動子進行了分析，預測出其可以被轉(zhuǎn)錄因子AP-1所調(diào)控。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)miR-192可以抑制IL-1RI3'UTR野生型報告質(zhì)粒的熒光活性，但對突變型無作用，這證實miR-192對IL-1R的抑制效應是嚴格依賴于“Seed region”與IL-1

6、RI mRNA之間的相互作用。熒光定量分析miR-192在鰻弧菌感染的脾臟組織和LPS刺激的鮸魚巨噬細胞中的表達量變化與IL-1 RI的變化趨勢相反，從而進一步證實miR-192對IL-1RI表達的調(diào)節(jié)作用。
　　3.本研究發(fā)現(xiàn)，TLR1在鰻弧菌感染的鮸魚脾臟組織中的表達量是顯著上升的。LPS是脂質(zhì)和多糖的復合物，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，對LPS刺激后的鮸魚脾臟及LPS刺激后的鮸魚巨噬細胞進行TLR1表達量的分析，發(fā)現(xiàn)其表

7、達量是上調(diào)的。通過生物學信息學的方法及雙熒光素酶報告基因篩選出miR-217可靶作用TLR1的3'UTR。通過miR-217可以抑制TLR13'UTR野生型報告質(zhì)粒的熒光活性而對突變型無作用，驗證了miR-217可以直接靶作用TLR13'UTR的“Seed region”。利用構(gòu)建的miR-217前體質(zhì)粒，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)miR-217前體有類似于miR-217模擬體的活性也可以靶作用TLR13'UTR而抑制熒光活性。另外