利用基因表達(dá)譜芯片篩選胃癌及轉(zhuǎn)移相關(guān)差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、本文應(yīng)用含有14784條人類全長(zhǎng)基因的cDNA表達(dá)譜芯片，以臨床切除的胃癌和正常胃粘膜組織、胃原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌組織標(biāo)本為研究對(duì)象，篩選胃癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移相關(guān)差異表達(dá)基因，進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR、免疫組化和Western印記分析驗(yàn)證部分差異表達(dá)基因在胃癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)，從分子水平闡釋胃癌及其轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)有效防治胃癌、提高胃癌患者長(zhǎng)期生存率具有重要的指導(dǎo)意義。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、標(biāo)本收集與臨床病理資料選取大連醫(yī)

2、科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科手術(shù)切除、病理檢查證實(shí)的胃癌6例，其中4例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，1例伴有肝轉(zhuǎn)移，每例于標(biāo)本離體后立即取胃原發(fā)癌組織、配對(duì)的正常胃粘膜及轉(zhuǎn)移灶癌組織，入液氮冷凍保存?zhèn)溆?。所選用病例術(shù)前均未行放療和化療，且經(jīng)組織學(xué)檢查證實(shí)。 2、cDNA微陣列芯片制備芯片采用上海生物芯片有限公司提供的人14KcDNA表達(dá)譜芯片，為監(jiān)控芯片雜交數(shù)據(jù)的可靠性，設(shè)定陽(yáng)性對(duì)照為看家基因(10個(gè))：陰性對(duì)照為細(xì)菌基因(6個(gè))：空白對(duì)照為點(diǎn)樣

3、液。人14KcDNA表達(dá)譜芯片基因總數(shù)14784個(gè)，矩陣點(diǎn)數(shù)為18點(diǎn)×18點(diǎn)×48(亞矩陣)，點(diǎn)間距230μm。 3、mRNA抽提按Trizol一步法分別抽提胃癌組織、正常胃粘膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移組織總RNA，采用QIAGEN Rneasy Kit進(jìn)一步純化總RNA，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳判斷28S和18S的亮度比例評(píng)價(jià)總RNA的質(zhì)量，分離mRNA。 4、標(biāo)記與雜交參照Schena等的方法逆轉(zhuǎn)錄cDNA探針并標(biāo)記mRNA，

4、分別用Cy5-dUTP和Cy3-dLJTP標(biāo)記不同組織的mRNA。將含混合探針的雜交液與芯片變性后，將雜交液滴于芯片點(diǎn)樣區(qū)，用蓋玻片覆蓋，置于雜交艙中，用Parafilm密封，放入42℃中溫水浴雜交16h。 5、結(jié)果分析采用激光共聚焦熒光掃描儀掃描芯片，用QuantArray<'R>分析軟件讀取數(shù)據(jù)，得出Cy3和Cy5標(biāo)記的強(qiáng)度值，計(jì)算Ratior值為Cy3/Cy5。結(jié)果分析：(1)總RNA提取結(jié)果良好；(2)Cy3和Cy5信號(hào)

5、熒光強(qiáng)度必須有一個(gè)>800；(3)Ratio(Cy3/Cy5)比值的自然對(duì)數(shù)絕對(duì)值>2或<0.5，判斷為差異表達(dá)基因。 6、 RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證部分表達(dá)差異基因取胃癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織的RNA在常規(guī)條件下從引物開始反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增，檢測(cè)篩選出的差異表達(dá)基因在胃癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)，對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 7、驗(yàn)證差異表達(dá)基因EphB4的蛋白水平采用免疫組化和Western印記方法對(duì)篩選出差異表達(dá)基因Ep

6、hb4在正常胃粘膜、不同分期的胃癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，同時(shí)探討EphB4表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系。 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用X<'2>檢驗(yàn)，四格表的確切概率法，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1、RNA質(zhì)量控制分別提取胃癌組織和癌旁正常組織中總RNA的含量在50ug～100ug之間，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析RNA，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，5S條

7、帶模糊，說(shuō)明RNA純度和完整性較好。 2、差異表達(dá)基因分析本研究測(cè)定了胃癌的全基因序列，篩選出胃癌及轉(zhuǎn)移相關(guān)差異表達(dá)基因。與正常胃粘膜組織相比，6例胃癌組織中共檢出40個(gè)差異表達(dá)基因，21條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)上調(diào)，19條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)下調(diào)。與胃癌組織相比，在4例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中共檢出46個(gè)差異表達(dá)基因，18條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)上調(diào)，28條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)下調(diào)。在肝轉(zhuǎn)移癌組織中共檢出178個(gè)差異表達(dá)基因，114條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)上調(diào)

8、，64條基因出現(xiàn)顯著表達(dá)下調(diào)。 3、驗(yàn)證部分差異表達(dá)基因?yàn)榱蓑?yàn)證cDNA芯片實(shí)驗(yàn)中差異表達(dá)基因，我們選擇7個(gè)差異表達(dá)明顯的基因在6例胃癌組織中進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，其中5個(gè)基因表達(dá)上調(diào)(S100A6，S100A1，ETV4，CDH17和Ephb4)、2個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(NK4和PPP2R1B)。進(jìn)一步選擇2個(gè)差異表達(dá)明顯的上調(diào)基因在4例胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，分別為S100A4和Ephb4，經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證其表

9、達(dá)趨勢(shì)與基因芯片檢測(cè)結(jié)果一致。 4、驗(yàn)證差異表達(dá)基因EphB4的蛋白水平免疫組化和Western blot結(jié)果顯示， EphB4陽(yáng)性表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞的胞漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，為棕黃色顆粒，染色均一，40例胃癌組織中EphB4的陽(yáng)性表達(dá)為23例(57.5％)，配對(duì)的正常胃粘膜組織中EphB4的陽(yáng)性表達(dá)為6例(15％)，兩組之間的差異具有顯著性(P<0.05)。EphB4表達(dá)水平與胃癌浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Lauren分型密切相關(guān)，與

10、患者的性別、年齡和分化程度無(wú)關(guān)。 研究結(jié)論： 1.經(jīng)基因芯片檢測(cè)分析，胃癌組織與正常胃黏膜相比基因表達(dá)存在明顯差異，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌灶、肝轉(zhuǎn)移癌灶與胃原發(fā)癌相比基因表達(dá)也存在明顯差異，提示胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多基因參與的過(guò)程、多基因變異的結(jié)果。 2.部分差異表達(dá)基因經(jīng)RT-PCR重復(fù)驗(yàn)證，S100A6，S100A11，ETV4，CDH17，NK4，PPP2R1B，S100A4和Ephb4基因異常表達(dá)可能參與胃癌發(fā)