應(yīng)用基因芯片篩選胃癌和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及生物信息學(xué)研究.pdf

1、研究背景:胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在我國其死亡率居惡性腫瘤首位.進展期胃癌的預(yù)后很差,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后差和導(dǎo)致患者死亡的根本原因.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的甲.期事件,也是胃癌預(yù)后的獨立因素,因此研究淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機制對于臨床腫瘤患者的診治具有十分重要的意義.腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移受多種因素調(diào)控,是多種生物分子和信號通路相互作用的復(fù)雜的生物學(xué)過程.傳統(tǒng)的研究方法一次只能檢測一個或幾個基因,很難詮釋腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的全部過程.DNA微

2、陣列是最有效的檢測腫瘤基因差異表達譜的技術(shù)之一,它對于探討胃癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機制,尋找胃癌早期診斷、判斷預(yù)后的分子標記物和臨床治療靶點具有非常重要的意義. 研究目的：本研究采用基因表達譜芯片技術(shù)比較正常胃粘膜(非腫瘤組織)、胃癌原發(fā)灶和胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的基因表達譜,旨在篩選與胃癌發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因,為進一步闡明胃癌發(fā)生和淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機制、評估胃癌病人預(yù)后和實施個體化治療奠定實驗基礎(chǔ). 方法：應(yīng)用TRI

3、zol法分別提取正常胃粘膜(A組)、胃癌原發(fā)灶(B組)和胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(C組)組織的總RNA,用HPLC純化T7-(d7)24 primer反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA,經(jīng)Phase Lock Gel fPLG)一酚氯仿純化后,以三種組織的cDNA為模板,應(yīng)用Affymetrix公司的BioArray High Yield RNA Transcript Labelingkit進行體外反轉(zhuǎn)錄,同時進行生物素標記,合成生物素化的cRNA探針.合

4、成好的cRNA探針質(zhì)控合格后經(jīng)片段化處理(大小約50-200bp之間),分別在Affymetrix公司的專用設(shè)備Affymetrix<○R>Ftybridization Oven 640中與Affymetrix Genechip HG-U133A2.0(包括22,277個轉(zhuǎn)錄本,對應(yīng)于約20,247個人已知基因和1475個EST)雜交16小時,雜交后的芯片經(jīng)過洗脫、染色處理,使用Affymetrix<○R>Scanner3000 7G對

5、雜交信號進行掃描,芯片掃描后獲得的數(shù)據(jù)利用Affymetrix<○R>GCOS software進行計算處理.在比較兩組芯片的結(jié)果之前,先對每張芯片的數(shù)據(jù)進行歸一化處理.以Signal Log Ratio≥1.0或≤-1.0(表明轉(zhuǎn)錄木的水平至少提高或降低2倍)和Change p-value(代表了兩張不同芯片之間一個探針對表達水平相同或不同的可能性)≤0.05(表明比較的結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義)作為篩選差異表達基因的標準,并用生物信息學(xué)對檢

6、測結(jié)果進行分析.為確保芯片檢測質(zhì)量,Affymetrix基因芯片內(nèi)還設(shè)有GAPDH等看家基因作為對照,以及BIOB,BIOC、.BIOD和CRE等外加的陽性對照以檢測基因芯片的質(zhì)量.應(yīng)用實時熒光定量PCR(Real time-PCR)定量檢測6個已知基因(COLlA2,SPPl,PTGDS,RAC2,TFFl,CXCR4)在三種組織的表達情況,以驗證基因芯片的檢測結(jié)果. 結(jié)果：基因芯片檢測報告表明,這三張芯片的背景值和噪音值都很

7、均勻,其中看家基因GAPDH的5＇端和3＇端的信號比值分別是1.26,1.05,1.17,均顯著低于3.0的標準值;外加的陽性對照BIOB、BIOC、BIOD和CRE也被檢測到,并且信號強度隨著濃度由低到高呈現(xiàn)由弱到強的趨勢,表明芯片質(zhì)量良好,雜交及檢測體系正常,芯片檢測結(jié)果真實可信.在總共22,277個轉(zhuǎn)錄本中,A組檢測到10,930個,占總轉(zhuǎn)錄本的49.1﹪:B組檢測到12353個,占總轉(zhuǎn)錄本的.55.50﹪;C組檢測到11825個

8、,占總轉(zhuǎn)錄本的53.1﹪.進一步利用Affymetrix公司的GCOS分析軟件對三組樣品的芯片檢測結(jié)果進行分析,并根據(jù)篩選標準篩選差異表達基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)B組(原發(fā)灶)同A組(正常胃粘膜)相比,B組表達上調(diào)轉(zhuǎn)錄本1052個,其中已知基因轉(zhuǎn)錄本761個,EST、291,表達下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本1301個,其中已知基因轉(zhuǎn)錄本810個,EST、491個;C組同B組比較,表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本1708個,其中已知基因轉(zhuǎn)錄本1005個,EST703個.本文只列出

9、了各組差異表達基因最顯著的前60個基因.根據(jù)GO(Gene Ontology)分類和聚類分析,按照其參與的生物學(xué)過程(Biological Process)和分子功能(Molecular Function)進行了初步的功能分類.在這些差異基因中,胃癌原發(fā)灶上調(diào)基因的功能主要集中在細胞周期、細胞生長增殖、細胞移動和粘附以及腫瘤基質(zhì)重塑與降解等方面,卜調(diào)基因的功能主要集中在胃腸道對外源性生物的代謝、正常的消化功能、免疫防御、細胞粘附(粘蛋白

10、為主)等方面;胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶上調(diào)基因的功能主要集中在細胞粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成與分解、細胞趨化和移動以及細胞周期等方面;下調(diào)的基因功能主要集中在物質(zhì)轉(zhuǎn)運、質(zhì)白質(zhì)等大分子代謝、細胞粘附、免疫反應(yīng)與防御等方面,反映了胃正常代謝、消化功能減退,防御保護功能削弱.同時我們通過生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件(隊列試驗的基因表達譜分析、基于Gene Omology分類的集群分析和Pathway分析)對實驗數(shù)據(jù)進行挖掘,結(jié)果顯示A、B、C組連續(xù)下調(diào)的基

11、因表達的主要趨勢(具有顯著性,P小于0.05)集中于糖類(包括多糖)代謝、上皮組織發(fā)育、以及細胞粘附等方面.A、B、C組連續(xù)上調(diào)的基因表達變化趨勢(具有顯著性,P小于0.05)集中\(zhòng)于免疫反應(yīng)、細胞粘附、細胞運動、細胞周期及調(diào)亡相關(guān)基因.通過Pathway分析發(fā)現(xiàn),整合素介導(dǎo)的細胞粘附信號通路中的THBSl、TLN、CAPN9、ITGAX和TGF信號通路中ENG、INHBA、Smad6和STAT1等基因在A、B、C三組呈梯度改變,提示這

12、些基因在胃癌轉(zhuǎn)移過程中可能起著重要作用. 結(jié)論： 1.利用基因芯片篩選胃癌及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因是一個高效、快速的方法. 2.本實驗結(jié)果顯示胃癌組織呈高增殖狀態(tài)、粘附和移動活躍、細胞周期和細胞粘附信號通路可能異常激活;間質(zhì)呈高反應(yīng)狀態(tài),細胞外基質(zhì)重塑和降解活躍;而胃正常的生物性代謝、消化功能紊亂,胃粘膜保護抗御功能被削弱. 3.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶上調(diào)的基因主要集中在免疫反應(yīng)、細胞粘附、細胞運動、細胞周期和凋亡相關(guān)基因,